鯉腸道內(nèi)產(chǎn)消化酶益生菌的分離與篩選

陳書暢，徐曄，曲樂天，夏騰，劉毅，許建和，程漢良

（江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005）

鯉（Cyprinus carpio）食性廣、生長速度快，適應(yīng)性強(qiáng)，食用價值高，是世界尤其是我國傳統(tǒng)的養(yǎng)殖魚類。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)朝著高密度、集約化方向發(fā)展，提高魚體免疫力和抗病力顯得尤為重要[1]。

腸道健康對于魚類的健康養(yǎng)殖意義重大。腸道發(fā)揮著多種作用：消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)、抵抗病原微生物和食物抗原對機(jī)體的影響、參與抗菌肽和攝食調(diào)控類激素的分泌等[2]。腸道內(nèi)定植著大量微生物，這些微生物也通過自身或其代謝產(chǎn)物影響魚類的營養(yǎng)代謝、系統(tǒng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等生理過程[3]。許多研究表明，益生菌在宿主腸道的粘附作用具有特異性，非同源的益生菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用效果并不理想[4]。所以種屬特異性是篩選益生菌首要條件，從水產(chǎn)動物腸道中分離篩選益生菌是目前大多數(shù)水產(chǎn)益生菌的主要篩選方法。因此，探究魚源益生菌生物特性，尋求一種高效安全的飼料添加劑型益生菌菌種勢在必行。本研究通過篩選一種安全有效、有較強(qiáng)產(chǎn)酶能力的鯉源益生菌，以期為鯉源益生菌的益生特性分析和安全使用提供參考，及為鯉益生菌制劑和發(fā)酵飼料的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚采自江蘇海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)前攝食鯉配合飼料。飼料制作完成后，采用高溫高壓滅菌處理（121℃、0.5 Mpa、滅菌15 min）。每天上午10：00 和下午3：00 各投喂一次，養(yǎng)殖4 周；養(yǎng)殖期間，水中溶氧量＞5 mg/L，水溫保持在（26±1）℃。

1.2 方法

1.2.1 取樣

試驗(yàn)魚饑餓24 h 后，選擇3 尾活潑、無外傷、體形正常的健康鯉，體質(zhì)量（109.6±2.8）g。經(jīng)MS-222麻醉，用無菌水沖洗數(shù)次，體表用75%的酒精消毒，在潔凈工作臺上，用無菌剪刀分離腸道，稱取3 尾鯉前腸共4.5 g，用滅菌生理鹽水沖洗數(shù)遍，剪碎，放入50 mL 滅菌的離心管中，加20 mL 滅菌生理鹽水，勻漿，再加20.5 mL 滅菌生理鹽水，制成10-1稀釋原液，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的配制

實(shí)驗(yàn)所用LB 和MRS 培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，芽孢桿菌富集培養(yǎng)基的配制參照王妹等[5]的方法，淀粉培養(yǎng)基、脂肪培養(yǎng)基配制參照羅璋[6]的方法，脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基參照沈萍等[7]的方法。

1.2.3 細(xì)菌計數(shù)

稀釋鯉腸道原液，分別取各稀釋液100 μL 均勻涂布在LB、MRS 和芽孢桿菌富集培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)18～24 h，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 13093-91，計算各培養(yǎng)基中細(xì)菌的數(shù)量[8]。

1.2.4 產(chǎn)酶菌株的初步篩選

分別純化LB、MRS、芽孢桿菌富集培養(yǎng)基中的細(xì)菌，各110 株，編號為：BH1001-BH1110、BH2001-BH2110、BH3001-BH3110。取培養(yǎng)出的單菌落用接種環(huán)點(diǎn)在淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選[9]。

1.2.5 菌株產(chǎn)酶活力測定

將上述篩選出的菌株分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)18～24 h，4 000 r/min 離心30 min，取上清液用南京建成生物工程研究所有限公司的蛋白酶試劑盒、淀粉酶試劑盒和脂肪酶試劑盒進(jìn)行測定[10]。

1.2.6 溶血試驗(yàn)

溶血平板購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，取純化后的單菌落接入溶血瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)24 h 后觀察是否有溶血圈生成。

1.2.7 菌株藥敏實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11]，采用藥敏紙片，每種抗菌藥物紙片（購于杭州濱和微生物試劑有限公司），均設(shè)3 個重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)《WS/T125-1999 紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判斷。

1.2.8 16S rDNA 分子鑒定

采用細(xì)菌16S 通用引物（27F）：5′-AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG-3′（1492R）：5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′。接種單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、振蕩180 r/min，培養(yǎng)24 h；取2.5 μL 的上一步產(chǎn)物作模板。PCR 反應(yīng)體系見表1。

表1 細(xì)菌16S rDNA 擴(kuò)增體系Tab.1 16S rDNA amplification system of the bacteria

PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃5 min，（94℃30 s，54℃30 s，72℃，30 s）共30 cycles，72℃7 min，12℃∞。

取5 μL 的PCR 產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶大小與預(yù)期大小相同，條帶單一且明亮。PCR 產(chǎn)物直接送上海生工測序。

1.2.9 生理生化鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]，采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管測定分離菌株生化特征，生理生化反應(yīng)管購置于杭州濱和微生物試劑有限公司，并用一株由本實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌作參照菌，進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，應(yīng)用相應(yīng)函數(shù)計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；采用IBM SPSS Statistics 23 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），數(shù)據(jù)差異顯著時，采用Duncan′s 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，差異水平定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉腸道的細(xì)菌數(shù)量

鯉腸道在LB 固體培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量為4.7×1015cfu/g，MRS 固體培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量為8.0×1013cfu/g，芽孢桿菌固體富集培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)量為6.7×1013cfu/g。

2.2 產(chǎn)酶菌株的初步篩選

從正常養(yǎng)殖的鯉腸道中分離出330 株菌株，經(jīng)初步篩選，能同時產(chǎn)三種酶的菌株35 株,其中12 株來自LB 固體培養(yǎng)基，7 株來自MRS 固體培養(yǎng)基，16株來自芽孢桿菌富集培養(yǎng)基。根據(jù)菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值結(jié)果，挑選出10 個值大的菌株BH1025、BH1065、BH1103、BH2094、BH2104、BH3 007、BH3044、BH3066、BH3080 和BH3098 進(jìn)行本試驗(yàn)，按順序重新進(jìn)行編號J1～J10。

2.3 產(chǎn)酶菌株的酶活測定

各菌株產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的比較結(jié)果見圖1～圖3，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。綜合菌株的三種產(chǎn)酶活力，J3、J5、J10 優(yōu)于其他菌種。

圖1 各菌株產(chǎn)蛋白酶活力的比較Fig.1 Comparison of protease activity among different strains

圖2 各菌株產(chǎn)脂肪酶活力的比較Fig.2 Comparison of lipase producing activities among different strains

圖3 各菌株產(chǎn)淀粉酶活力的比較Fig.3 Comparison of amylase activity among different strains

2.4 菌株溶血實(shí)驗(yàn)

在J1-J10 菌株溶血性試驗(yàn)中，J2、J3、J5、J7、J9和J10 菌株不產(chǎn)生溶血圈，說明這些菌株不釋放溶血毒素，是相對安全的候選益生菌。

2.5 菌株藥敏實(shí)驗(yàn)

綜合菌株的產(chǎn)酶能力、溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬選J3、J5、J10 為備選益生菌株。各菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。菌株J3 對青霉素、紅霉素、利福平、氨芐西林和麥迪霉素抗生素產(chǎn)生了耐藥性，菌株J5 對青霉素抗生素產(chǎn)生了耐藥性，菌株J10 號對青霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、氨芐西林和麥迪霉素抗生素產(chǎn)生了耐藥性。菌株是否攜帶耐藥因子，是環(huán)境釋放安全與否的重要指標(biāo)之一[13]，為了保證安全性，最終選定J5 為候選益生菌株。

表2 各菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity test results of each strain

2.6 16S rDNA 分子鑒定

將測得菌株J5 的16S rDNA 序列在GenBank中進(jìn)行blast 序列比對。結(jié)果顯示：J5 細(xì)菌與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 的相似性為100%。

2.7 生理生化鑒定

擬選菌株的生理生化結(jié)果見表3。與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》比對，再參照16S rDNA 測序結(jié)果，最終確定J5 為Bacillus subtilis。

表3 J5 的生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of J5

3 討論

本研究以篩選適合鯉飼料添加型的益生菌為主要目的。根據(jù)魚類的食性選擇合適的益生菌，草食性的魚可選擇產(chǎn)淀粉酶高的細(xì)菌做益生菌，肉食性的魚可選擇產(chǎn)脂肪酶高的細(xì)菌作益生菌。鯉為雜食性魚類，應(yīng)該選擇分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌作為益生菌[6]。在篩選益生菌的過程中，初步比較了細(xì)菌的產(chǎn)酶能力，并進(jìn)一步檢測了細(xì)菌的溶血性和抗生素的敏感性，將產(chǎn)酶能力和安全性高、攜帶抗生素耐藥因子少的菌株篩選出作為潛在益生菌，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

益生菌通常作為疾病控制劑的輔助劑，甚至替代抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病防治中[14]。益生菌具有提高動物消化吸收飼料的重要作用[15-17]。本實(shí)驗(yàn)初篩具有同時產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力的菌株35 株，選取10 種透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株，進(jìn)一步測定產(chǎn)酶能力，發(fā)現(xiàn)比值的大小與菌株產(chǎn)酶能力的大小并不具有很強(qiáng)的相關(guān)性，產(chǎn)酶能力的高低須經(jīng)具體測定酶活方可確定。產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力比較分析表明，J3、J5、J10 產(chǎn)酶活力強(qiáng)。

益生菌的篩選到應(yīng)用存在著安全隱患，候選菌株是否具有較強(qiáng)的抗藥性，是否產(chǎn)生溶血毒素都是必須要考慮的問題。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了菌株藥敏性和溶血實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)部分菌株具有很強(qiáng)的耐藥性，尤其是對常見的抗生素，這可能與魚類養(yǎng)殖中頻繁使用抗生素有關(guān)。黃志堅等[18]檢測了194 株（62 個屬）分離自水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境的革蘭氏陰性菌和陽性菌對5 種常用抗生素的抗性。結(jié)果表明水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中均存在不同程度的抗生素污染。部分菌株在進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)時存在著較大的溶血圈，表明這些菌株會產(chǎn)生溶血毒素，是潛在的致病菌，應(yīng)排除在候選益生菌之外。綜合產(chǎn)酶能力和細(xì)菌的溶血性結(jié)果，菌株J3、J5 和J10 更具有開發(fā)前景。但菌株J3 對5 種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，菌株J10 號對6 種抗生素產(chǎn)生了耐藥性。該菌株中可能存在耐藥因子，這是環(huán)境釋放安全與否的重要指標(biāo)之一[11]，所以為了保證安全性，應(yīng)將該菌株舍棄。

結(jié)論

菌株J5 具有較強(qiáng)的分泌蛋白酶、淀粉酶和淀粉酶能力；對絕大多數(shù)抗生素敏感，安全性更好，參照16 S rDNA 測序結(jié)果，并與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》比對，最終確定J5 為枯草芽孢桿菌。該菌是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的可以作為飼料添加劑的微生物菌種，更具有開發(fā)前景。