上調(diào)miR-210對(duì)糖尿病足模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制研究

聶興 王雪鷹 安靜思

糖尿病足屬于糖尿病中一種嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，主要是由于糖尿病導(dǎo)致患者血管、神經(jīng)發(fā)生病變，因此增加了治療的難度[1]。有研究指出，在糖尿病足發(fā)病過(guò)程中，創(chuàng)面組織中的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)會(huì)被持續(xù)激活，影響創(chuàng)面修復(fù)，也是導(dǎo)致糖尿病足患者久病不愈的主要原因，嚴(yán)重的會(huì)造成患者截肢[2,3]。目前臨床中關(guān)于糖尿病足的發(fā)病機(jī)制尚不明確。微小核糖核酸(miRNA)屬于一種高度保守的非編碼小分子RNA，在血管新生調(diào)節(jié)中起到重要的參與作用。有研究指出，miR-210過(guò)表達(dá)有助于毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，通過(guò)介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)有助于內(nèi)皮細(xì)胞遷移[4]。目前臨床中治療糖尿病足主要通過(guò)全身綜合治療原則，給予擴(kuò)血管、抗凝、降糖、抗菌、改善微循環(huán)等，必要情況下進(jìn)行介入治療以及骨髓造血干細(xì)胞移植等，雖然取得的治療效果顯著，能降低患者的致殘率和致死率，但是產(chǎn)生的不良反應(yīng)較多[5,6]。本文研究上調(diào)miR-210對(duì)糖尿病足模型大鼠的干預(yù)效果及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康、清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，體重220～260 g，均由河北醫(yī)科大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(冀)2020-002。鼠齡為6～8周。所有大鼠給予常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，黑/白光照交替12 h，溫度為20～25℃，濕度為40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病足模型建立:40只大鼠隨機(jī)選取10只為空白組，剩余30只參考唐乾利等[7]建立糖尿病足模型，采用1%的STZ(60 mg/kg)給予腹腔注射，建立糖尿病模型，1周后大鼠血糖>16.7 mmol/L說(shuō)明模型建立成功，成功27只。使用圖章在空白組和模型組大鼠足部部位印矩形標(biāo)記(3 mm×7 mm)，使用剪刀將大鼠全層皮膚剪除后，剪至筋膜，建立糖尿病足模型。

1.2.2 分組及干預(yù):27只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組，每組9只。miR-210上調(diào)轉(zhuǎn)染miR-210實(shí)現(xiàn)，100nM轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染miR-210，分為miR-210上調(diào)組，陰性對(duì)照組使用100nM轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列干預(yù)，均由廣州銳博公司提供。模型組、空白組2組均給予等體積的0.9%氯化鈉溶液干預(yù)。4組均連續(xù)干預(yù)5 d。

1.2.3 miR-210檢測(cè):取大鼠尾部靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取得上層血清，放置-20℃凍箱內(nèi)備用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：將采集到的100 μl血清加300 μl Trizol震蕩混勻靜置10 min，加80 μl氯仿再次震蕩混勻靜置5 min，離心后凝膠離心至管底，加100 μl DEPC水。將標(biāo)本混合液15 000 r/min，離心處理15 min。提取上清至液轉(zhuǎn)移到含糖原EP管中，加等體積預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃靜置2 h。提取白色沉淀加1 ml的75%乙醇，混勻后充分洗滌RNA沉淀，4℃ 7 500 g，離心處理5 min，摒棄上清液。加80 μl DEPC水對(duì)RNA沉淀進(jìn)行溶解，-80℃保存。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan? miRNA Reverse Transcription Kit)逆轉(zhuǎn)成cDNA，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以外源性cel-mir-39-3p作參照，采用2-ΔΔCT法對(duì)miR-210表達(dá)水平分析。

1.2.4 創(chuàng)面愈合率統(tǒng)計(jì):觀察各組大鼠干預(yù)后3 d、5 d 創(chuàng)面愈合情況，通過(guò)滌綸投影膜將大鼠創(chuàng)面覆蓋，掃描大鼠創(chuàng)面大小，經(jīng)過(guò)圖像分析儀計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.5 病理組織觀察:干預(yù)后5 d大鼠麻醉處死后，采集大鼠足部組織，提取后采用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，將粘附在其表現(xiàn)的異物清除干凈，干凈紗布將表面水分吸干后制備切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，染色15 min后使用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，計(jì)算大鼠心肌梗死面積。之后切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，蘇木精染色5 min，流水沖洗后給予伊紅染色30 s，觀察。

1.2.6 炎性因子、血管內(nèi)皮活性相關(guān)因子水平檢測(cè):酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)：提取標(biāo)本包被液，對(duì)TGF-β 0.1 ml進(jìn)行適當(dāng)稀釋，進(jìn)而加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中。加蓋 4℃ 24 h保存。次日使用洗滌液進(jìn)行3次全方位洗滌，甩干；各孔內(nèi)加不同稀釋倍數(shù)的待檢標(biāo)本0.1 ml，同時(shí)增加陽(yáng)性和陰性對(duì)照，置于43℃溫箱60 min，移去液體。同上述法則洗滌3次，甩干；各孔內(nèi)加稀釋IL-18、TNF-α、VCAM-1、ET、NO、NOS 0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前法洗3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min；各孔內(nèi)加2 mol的IL-18、TNF-α、VCAM-1、ET、NO、NOS 0.05 ml，終止反應(yīng)。試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所，試驗(yàn)操作嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書的步驟進(jìn)行。

1.2.7 VEGF-PI3K/AKT-eNOS表達(dá)檢測(cè):采用免疫印跡(Western blot)將標(biāo)本提取液，通過(guò)1 000 r/min離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復(fù)凍融后，120 000 r/min離心處理，提取上清液，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)VEGF、SDF1α、AKT、eNOS蛋白濃度，保存。滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加5 μl Marker、變性蛋白樣品，電泳干預(yù)30 min，待蛋白分離膠底，結(jié)束電泳；轉(zhuǎn)膜成功后將硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜在5%的脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗(Notch1、Hes1、HIF-1α 1∶1 000)孵育，經(jīng)過(guò)震蕩洗膜后加二抗(Notch1、Hes1、HIF-1α 1∶10 000)，孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果給予分析。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠miR-210表達(dá)比較 模型組、陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組miR-210表達(dá)均低于空白組；陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組miR-210表達(dá)高于模型組；miR-210上調(diào)組miR-210表達(dá)高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠miR-210表達(dá)比較

2.2 4組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 模型組、陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組干預(yù)后3 d、干預(yù)后5 d創(chuàng)面愈合率均低于空白組；陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組干預(yù)后3 d、干預(yù)后5 d創(chuàng)面愈合率高于模型組；miR-210上調(diào)組干預(yù)后3 d、干預(yù)后5 d創(chuàng)面愈合率高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。4組干預(yù)后5 d創(chuàng)面愈合率均高于4組干預(yù)后3 d(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.3 4組病理組織觀察 干預(yù)后5 d，空白組創(chuàng)面組織中，具有豐富的毛細(xì)血管，管腔大，與創(chuàng)面呈垂直分布未發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組創(chuàng)面組織有大量的炎性細(xì)胞，含有豐富的中性粒細(xì)胞，而新生毛細(xì)血管數(shù)量少，且管腔較?。魂幮詫?duì)照組和miR-210上調(diào)組創(chuàng)面組織中可見(jiàn)有不同數(shù)量的毛細(xì)血管，管徑較正常增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，其中miR-210上調(diào)組改善最明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 4組病理組織觀察(HE染色×200)

2.4 4組炎性因子相關(guān)指標(biāo)比較 干預(yù)后5 d，模型組、陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組IL-18、TNF-α、VCAM-1水平均高于空白組；陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組IL-18、TNF-α、VCAM-1水平低于模型組；miR-210上調(diào)組IL-18、TNF-α、VCAM-1水平低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組炎性因子相關(guān)指標(biāo)比較

2.5 4組大鼠血管內(nèi)皮活性相關(guān)因子水平比較 干預(yù)后5 d，模型組、陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組ET水平均高于空白組，NO、NOS水平低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組ET水平低于模型組，NO、NOS水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-210上調(diào)組ET水平低于陰性對(duì)照組，NO、NOS水平高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組大鼠血管內(nèi)皮活性相關(guān)因子水平比較

2.6 4組大鼠VEGF-PI3K/AKT-eNOS表達(dá)比較 干預(yù)后5 d，模型組、陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表達(dá)均高于空白組；陰性對(duì)照組、miR-210上調(diào)組VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表達(dá)低于模型組；miR-210上調(diào)組VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表達(dá)低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖2。

表5 4組大鼠VEGF-PI3K/AKT-eNOS表達(dá)比較

圖2 4組大鼠VEGF-PI3K/AKT-eNOS表達(dá)比較

3 討論

糖尿病足發(fā)病的主要原因是因?yàn)榛颊唛L(zhǎng)時(shí)間高血糖，引起血管病變，導(dǎo)致嚴(yán)重的缺血性及發(fā)生，大部分患者伴隨側(cè)枝血管形成能力損傷[8]。糖尿病足患者主要的臨床表現(xiàn)是患者肢體末端疼痛，伴有感染、潰瘍、壞疽等發(fā)生，嚴(yán)重影響患者精神和身體健康[9]。因此臨床中選擇科學(xué)的治療手段對(duì)患者來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

miRNAs可以與靶基因miRNA結(jié)合，參與基因調(diào)節(jié)過(guò)程，在對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[10]。miR-210是miRNAs成員之一，在腎損傷、糖尿病以及糖尿病合并血管并發(fā)癥患者中表達(dá)升高，是糖尿病腎病早期診斷的主要生物標(biāo)志物[11,12]。有研究證實(shí)，通過(guò)抑制miR-210能避免血管生成，減少內(nèi)皮細(xì)胞遷移[13]。郭勇英等[14]研究也認(rèn)為，在持續(xù)的高血糖狀態(tài)下，干細(xì)胞移植能實(shí)現(xiàn)miR-210表示上調(diào)，在毛細(xì)管狀結(jié)構(gòu)形成、內(nèi)皮細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組miR-210表達(dá)最低，提示在糖尿病足模型中miR-210表達(dá)降低。傷口愈合屬于一種復(fù)雜的細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程，其中角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等均會(huì)被激活，會(huì)釋放大量的生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子等，對(duì)糖尿病足治療起到一定的協(xié)調(diào)和維持作用[15,16]。本研究指出，上調(diào)miR-210能提高糖尿病足模型大鼠創(chuàng)面愈合率，從而加快大鼠創(chuàng)面愈合速度。

糖尿病足創(chuàng)面常常有大量的氧自由基生成，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定的介導(dǎo)作用，同時(shí)還能促進(jìn)炎性細(xì)胞活化，在創(chuàng)面中浸潤(rùn)，釋放大量的炎性細(xì)胞因子，對(duì)創(chuàng)面修復(fù)起到一定的消極影響[17]。IL-18、TNF-α屬于一種常見(jiàn)的炎性因子，具有促炎作用，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)被放大。VCAM-1屬于一種黏附細(xì)胞因子，對(duì)炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞黏附有介導(dǎo)作用，參與炎性細(xì)胞在創(chuàng)面中黏附、浸潤(rùn)過(guò)程[18]。本文研究結(jié)果指出，上調(diào)miR-210能降低糖尿病足大鼠IL-18、TNF-α、VCAM-1水平，從而抑制炎性反應(yīng)。

研究證實(shí)高糖高脂參與血管內(nèi)皮損傷過(guò)程，主要是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間受高血糖的影響，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)伴隨慢性、免疫性損傷，導(dǎo)致血管中活性物質(zhì)分泌紊亂，釋放大量的ET、血栓素，舒血管物質(zhì)NO、NOS因子大量減少，導(dǎo)致血管收縮功能失衡，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大量血小板聚集黏附，血液供應(yīng)不足[19,20]。本研究證實(shí)，上調(diào)miR-210能降低模型大鼠ET水平，抑制NO、NOS水平，從而改善糖尿病足大鼠血管內(nèi)皮損傷。SDF1α、NO均屬于血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)遷移、運(yùn)動(dòng)成員，有助于EPCs向傷口部位遷移，促進(jìn)傷口部位新生血管產(chǎn)生，加快傷口愈合[21]。本研究顯示，上調(diào)miR-210能降低模型大鼠VEGF、SDF1α、AKT、eNOS表達(dá)，從而將VEGF-PI3K/AKT-eNOS信號(hào)通路激活，參與糖尿病足模型大鼠創(chuàng)面愈合調(diào)節(jié)過(guò)程。

綜上所述，上調(diào)miR-210能提高糖尿病足模型大鼠創(chuàng)面愈合率，抑制炎性反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮活性，其作用機(jī)制可能與VEGF-PI3K/AKT-eNOS信號(hào)通路有關(guān)，為臨床糖尿病足靶向治療提供理論依據(jù)。