眼表菌群與眼表疾病關(guān)系的研究進展

林育安，張玉潔，石珂 綜述 吳護平，歐尚坤,3 審校

(1.廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心，福建 廈門 361003；2.福建省眼表與角膜病重點實驗室，福建 廈門 361003；3.廈門大學(xué)眼科研究所，福建 廈門 361003)

眼表位于眼球的最外面，是一個精細(xì)而復(fù)雜的系統(tǒng)，包括角膜、結(jié)膜、眼瞼、瞼板腺、淚腺和神經(jīng)、血管網(wǎng)絡(luò)等。眼表暴露于外部壞境，直接接觸于空氣，有特定的菌群定植于眼表，與眼表的組織、細(xì)胞以及細(xì)胞因子共同構(gòu)成一個整體，形成一個穩(wěn)定的眼表微環(huán)境，對維持眼部健康起著極其重要的作用[1]。在正常情況下，眼表菌群中的各種微生物處于一個微妙的平衡狀態(tài)，與人體眼表組織的細(xì)胞和平共生，共同維持眼表的健康[2]。但在環(huán)境改變或免疫力低下的情況下，這種平衡狀態(tài)被打破[3]，某些微生物異常繁殖，導(dǎo)致菌群失調(diào)，成為致病菌，引起眼表微環(huán)境的變化，可導(dǎo)致眼表感染及一系列的眼表病變，甚至進入眼內(nèi)引起眼內(nèi)炎，嚴(yán)重影響眼部健康[4]。

1 正常眼表菌群的研究

在傳統(tǒng)的方式中，顯微鏡下染色檢查和微生物培養(yǎng)是確定眼部微生物的主要方式[5]。介于共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy，IVCM)[6]和眼前段光學(xué)相干斷層掃描(anterior segment optical coherence tomography，AS-OCT)[7]技術(shù)的發(fā)展，也逐漸用于輔助檢測眼表微生物。隨著16SrDNA細(xì)菌DNA擴增測序技術(shù)的不斷發(fā)展，其廣泛應(yīng)用于分析眼表菌群，發(fā)現(xiàn)了眼表存在不可培養(yǎng)的微生物類型，這豐富了我們對眼表菌群的多樣性的認(rèn)識[5,8]。目前，在眼表發(fā)現(xiàn)221種細(xì)菌，59屬5個門。正常的眼表菌群以革蘭氏陽性菌為主，如葡萄球菌、棒狀桿菌、鏈球菌和丙酸桿菌等；其次為革蘭氏陰性菌，如嗜血桿菌、奈瑟菌、假單胞菌[9-10]。眼表菌群在男性和女性中只在β多樣性上存在差異，但不同年齡的眼表菌群在微生物組成、代謝功能和抗生素抗性基因的豐度方面存在顯著差異[11]。在老年群體中，含有更多的貪婪丙酸桿菌、大腸桿菌、滕黃微球菌、金黃色葡萄球菌、大芬戈爾德菌等，而在青年的群體中含有更多的痤瘡丙酸桿菌、豬鼻支原體、人蒼白桿菌、綠膿桿菌、牛支原體等[11-12]。真菌并不是眼表的正常微生物，偶有分離得到白色念珠菌、青霉菌、曲霉菌、鐮孢菌屬和分支孢子菌屬，它們多為來自空氣和環(huán)境的隨機污染，呈短暫性，其檢出率只有1.3%～13.0%[13-14]。

透過眼表菌群的培養(yǎng)或16SrDNA測序能夠鑒別眼表疾病患者菌群與正常菌群的差異，可以幫助進一步對疾病的理解，對眼表疾病的診斷或治療提供參考。同時，身體其他部位相關(guān)的菌群也可能通過血行播種，影響或參與某些眼科疾病[15-16]，與眼部疾病的產(chǎn)生與發(fā)展關(guān)系密切，對人類的健康造成巨大的危害[17-18]。

2 眼表菌群與眼表疾病的關(guān)系

2.1 角膜炎與眼表菌群

角膜直接與外部環(huán)境接觸，易受到外來因素的影響。各種因素引起的眼表微環(huán)境變化，都可引起角膜的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致角膜水腫、角膜潰瘍，甚至角膜穿孔，嚴(yán)重威脅患者的視力。感染性角膜炎是引起角膜炎最常見的原因，其致病菌種類較多，主要以革蘭氏陽性菌為主，如表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等；革蘭氏陰性菌相對少見，主要是假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、大腸埃希菌[19-21]。有學(xué)者在分析單側(cè)感染性角膜炎的患者中，發(fā)現(xiàn)對側(cè)的眼表菌群體也發(fā)生了相似的改變[22]。

導(dǎo)致感染最常見的是表皮葡萄球菌，表皮葡萄球菌目前已成為臨床上最為常見的致病菌，表皮葡萄球菌分泌的半胱氨酸蛋白酶、溶血素毒素等可以干擾眼表免疫機制的作用，同時也能形成生物膜幫助其逃避宿主防御[23]。銅綠假單胞菌也是僅次于表皮葡萄球菌的病原菌，銅綠假單胞菌定植于角膜進行快速繁殖，產(chǎn)生黏附因子作用于角膜造成急性感染，通常迅速進展為急性化膿性潰瘍，角膜中央會形成白色浸潤，分泌膿性分泌物，伴隨角膜基質(zhì)凝固性壞死，并通過群體感應(yīng)系統(tǒng)和蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)釋放毒力因子，而加重角膜損傷[24]。醫(yī)院獲得性的克雷伯氏菌可能會造成嚴(yán)重的眼部感染，且具有很強的耐藥性，而大腸桿菌是常見的環(huán)境病原體，大多數(shù)來自異體移植的供體或是生活環(huán)境[25]。在復(fù)發(fā)性感染性角膜炎患者中，內(nèi)源性金黃色葡萄球菌明顯增加，瞼緣、結(jié)膜或鼻腔等其他部位可能是復(fù)發(fā)性感染性角膜炎內(nèi)源性感染的來源[26]。

真菌性角膜炎主要是植物創(chuàng)傷引起，但隨著角膜移植等手術(shù)長期使用抗生素藥物等的增加，真菌性角膜炎的發(fā)病率逐漸增加[27]。由真菌引起的真菌性角膜炎，不同地區(qū)的致病菌也不完全一致，主要致病菌有絲狀菌(如鐮刀菌、曲霉菌及酵母菌等)、白色念球菌及青霉菌等[13]。真菌的繁殖、霉菌毒素、分泌的蛋白水解酶和真菌抗原激活機體感染的炎癥反應(yīng)使角膜的免疫防御系統(tǒng)改變，真菌可穿透角膜間質(zhì)，形成深度感染，而絲狀真菌如鐮刀菌形成的生物膜也是發(fā)病機制中的一個重要因素[28]。常見的鐮刀菌和曲霉更容易生長在人體角膜中央，形成生物膜的鐮刀菌分離株比浮游菌分離株表現(xiàn)出更高的耐藥性，而白色念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白有助于逃離免疫抑制。真菌感染的變化對眼表的共生菌群造成失衡，而對眼表結(jié)構(gòu)造成損害，進一步加重感染?；?6SrDNA分析對真菌性角膜炎患者的結(jié)膜拭子和角膜刮屑進行分析，發(fā)現(xiàn)眼表菌群發(fā)生明顯變化，尤其是曲霉菌、鐮刀菌、馬拉色菌、血珠菌、念珠菌、青霉菌、鐮刀菌、鐮刀菌等[13]。近來益生菌的使用也開始運用在預(yù)防疾病中，對真菌抑制的作用有了進一步的探索[27-28]，可能是治療真菌性角膜炎的新的方式。

在佩戴角膜接觸鏡的患者中，感染性角膜炎的發(fā)生率明顯增加[29-30]。對佩戴角膜接觸鏡的患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)其眼表菌群發(fā)生了明顯改變[30]。最豐富的4個屬是假單胞菌、內(nèi)水桿菌、葡萄球菌和角桿菌，進一步發(fā)現(xiàn)這樣的改變增加了感染性角膜炎的發(fā)生風(fēng)險，導(dǎo)致隱形眼鏡相關(guān)的細(xì)菌性角膜炎。

2.2 結(jié)膜炎與眼表菌群

結(jié)膜炎病因復(fù)雜，可以分為感染性結(jié)膜炎以及非感染性結(jié)膜炎。感染性結(jié)膜炎中以細(xì)菌感染性結(jié)膜炎為主，趙榮超團隊透過細(xì)菌性結(jié)膜炎患者1 350例，檢出以革蘭氏陽性為主，主要為表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、溶血葡萄球菌、產(chǎn)氣葡萄菌等[31]。而小兒急性細(xì)菌性結(jié)膜炎主要為金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌，可能與解剖結(jié)構(gòu)與免疫系統(tǒng)發(fā)育的不完善有關(guān)[32]。

非感染性結(jié)膜炎主要是過敏性結(jié)膜炎，在過敏性結(jié)膜炎患者中，菌群的多樣性較一般正常人豐富，同時發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、放線菌門以及藍(lán)藻菌門的細(xì)菌數(shù)量增加；此外，在過敏性結(jié)膜炎中，眼部菌群和鼻部的菌群存在相互作用，鼻淚管在解剖學(xué)上連接眼的淚囊和鼻腔，過敏性結(jié)膜炎的患者可能透過眼淚或摩擦鼻腔使結(jié)膜與鼻部的菌群互相產(chǎn)生流動，結(jié)膜的共生菌群的變化增加了對疾病的影響[33]。

2.3 瞼緣炎與眼表菌群

瞼緣炎是指眼瞼及其包括皮膚、睫毛和瞼板腺在內(nèi)的相關(guān)附屬組織的炎癥為特征的一類疾病。典型的瞼緣炎患者前后瞼緣可同時受累，通常呈慢性間歇性發(fā)作[34]。瞼緣的長期慢性炎癥會導(dǎo)致瞼緣潰瘍、干眼和瞼緣炎相關(guān)角結(jié)膜病變等，但目前瞼緣炎的病因及致病機制尚未明確[35]。研究[36-37]指出：與正常人相比，瞼緣炎患者的眼表菌群多樣性無差異，瞼緣炎患者中丙酸桿菌、葡萄球菌、不動桿菌和棒狀桿菌屬成員被確定為眼瞼或瞼炎的主要微生物群。但瞼緣炎患者眼表帶菌量要高于正常人，且革蘭氏陽性球菌在菌群占有的比例不同，而厭氧菌帶菌量要低于正常人[38]。瞼緣炎帶菌量的增加造成了炎性反應(yīng)的延長，而厭氧菌的痤瘡丙酸桿菌低于正常人則可能是瞼緣炎的一個保護因素。臨床上的瞼緣炎與蠕行螨高度相關(guān)。蠕形螨性瞼緣炎患者結(jié)膜囊內(nèi)有不同程度的細(xì)菌菌群失衡，而蠕形螨作為轉(zhuǎn)移皮膚和環(huán)境菌群的載體可能是其潛在的發(fā)病機制[39]。在瞼緣炎患者和健康對照中發(fā)現(xiàn)了混合皮膚微生物菌群，由此推測人的瞼緣炎可能是由混合皮膚微生物菌群的感染引起的；而蠕形螨作為載體增加了將環(huán)境菌群帶入到眼部的機會。因為眼部健康和瞼緣炎可能取決于眼睛和眼表菌群之間的相互作用，維持眼部微生物群之間的平衡或共生生長可能對瞼緣炎的預(yù)防很重要。

2.4 干眼與眼表菌群

干眼是以淚膜功能異常為主要特征的眼部疾病，常伴有眼干澀感、異物感等眼部不適癥狀，分為淚液生成不足型干眼和蒸發(fā)過強型干眼[40]。在干眼中，通過培養(yǎng)鑒定出的大多數(shù)細(xì)菌是凝固酶陰性的葡萄球菌；在進一步通過16SrDNA的細(xì)菌DNA擴增測序發(fā)現(xiàn)，在干眼的患者含有眼表非典型的菌群，包括克雷伯氏菌、紅串紅球菌和歐文氏菌[3,41]。干眼患者正常菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，相較健康的眼表環(huán)境的菌群分布，特有菌群的增加破壞原有的微環(huán)境平衡也提示了機會致病菌的可能性。而同時發(fā)現(xiàn)這些菌群的增加與杯狀細(xì)胞密度降低有關(guān)。杯狀細(xì)胞的減少及喪失是干眼的特征之一，而杯狀細(xì)胞的丟失表現(xiàn)為淚黏液蛋白5 AC(mucin 5 AC，MUC5 AC)水平的降低使眼表高滲狀態(tài)持續(xù)、惡化，加重干眼程度。干燥綜合征是一種特殊類型的淚液生成不足型干眼。通過16SrDNA的細(xì)菌DNA擴增測序，發(fā)現(xiàn)干燥綜合征患者眼表菌群的多樣性較正常人高，以大腸埃希菌等革蘭氏陰性桿菌最為常見[42]，部分機會致病菌的豐度明顯增加，如假單胞菌、假葡萄球菌、鏈球菌、不動菌等致原菌比例較高[43]。不同于健康眼表菌群的分布，這些變化可能與嚴(yán)重的眼表異常有關(guān)，包括上皮損傷、水蛋白層和黏蛋白層減少，提示了更高比例的潛在致原微生物。蒸發(fā)過強型干眼主要為瞼板腺功能障礙。雖然在瞼板腺功能患者中菌群的數(shù)量沒有明顯差異，但是存在a和b統(tǒng)計學(xué)差異，推測眼表菌群失調(diào)與瞼板腺功能障礙密切相關(guān)[44]。有研究[41]進一步發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重瞼板腺功能障礙患者組的細(xì)菌類型數(shù)量明顯高于健康對照組，瞼板腺體脂質(zhì)異常被認(rèn)為與眼表微生物群組成的變化有關(guān)。瞼板腺管阻塞導(dǎo)致的脂質(zhì)積累限制了其殺菌能力，從而增強了眼表微生物的增殖。研究[45]顯示：瞼板腺功能障礙患者可檢測出含有大量的大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和屎腸球菌病原體，這些細(xì)菌在健康對照組中幾乎不存在，正常微生物群落的變化和優(yōu)勢菌的轉(zhuǎn)化可能與瞼板腺功能障礙有關(guān)，較高的桿菌含量也提示了瞼板腺功能障礙相關(guān)的干眼可能與瞼緣炎和眼表蠕形螨感染有關(guān)。目前為止，在沒有明顯的臨床感染的情況下，對于干眼的患者是否需要進行抗生素干預(yù)仍然存在爭議，但在干眼患者中，更容易產(chǎn)生抗氟喹諾酮類結(jié)膜細(xì)菌[41]。這些結(jié)果可能有助于預(yù)防和治療干眼患者誘發(fā)感染性角膜結(jié)膜炎。

2.5 翼狀胬肉與眼表菌群

翼狀胬肉是常見的眼表疾病之一，單眼多發(fā)，也可以雙眼發(fā)病，主要發(fā)生在眼部的鼻側(cè)、顳側(cè)的瞼裂區(qū)，異常增生的纖維血管樣組織從結(jié)膜向角膜表面增生，形狀像昆蟲的翅膀。其病因目前傷存在爭議，通常認(rèn)為與紫外線長期暴露有關(guān)。可以使患者出現(xiàn)異物感、見風(fēng)流淚等癥狀，甚至引起視力下降[46]。有研究[47]指出：翼狀胬肉患者等眼表優(yōu)勢菌群與正常人的類似，以革蘭氏陽性菌為主，如棒狀桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、丙酸桿菌等，但棒狀桿菌的豐度明顯增高，這樣的變化與眼表的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，可能促進了翼狀胬肉的發(fā)生與發(fā)展。此外，翼狀胬肉切除術(shù)后分離出最常見的病原菌是嗜麥芽鏈球菌，這可能與術(shù)后鈣化斑塊和傳染性鞏膜炎發(fā)生的潛在因素[48]。

2.6 全身疾病與眼表菌群

眼表群菌來自體內(nèi)及外在環(huán)境，而體內(nèi)不同部位的特殊微生態(tài)也會互相影響，對于人體的免疫防御機制或疾病發(fā)生發(fā)展密不可分。有學(xué)者[49]發(fā)現(xiàn)眼表上皮獨特的天然免疫反應(yīng)可能有助于其與共生細(xì)菌共存，并透過小鼠實驗提出先天免疫功能障礙異常會導(dǎo)致眼表炎癥。而在過敏性鼻結(jié)膜炎患者中，眼部和鼻腔間的微生物群相互作用[33]。另外，有研究[50]顯示眼表菌群的差異和2型糖尿病的病程有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明2型糖尿病患者的眼表菌群與健康受試者有顯著差異，這可能與眼表不適以及2型糖尿病病程相關(guān)。糖尿病患者的高血糖和全身炎癥可能促進潛在病原體的生長和定植[51]。老年人眼表免疫相關(guān)的患病率有所增加，Mashaghi團隊[52]提出衰老對眼表先天免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵影響，如Th1及Th17細(xì)胞的增加，可能使老年人對自身抗原的反應(yīng)性增加導(dǎo)致了自身免疫和慢性炎癥的發(fā)生，從而促使眼表菌群的變化。

3 結(jié)語

正常微生物群在防止致病物種增殖方面具有保護性免疫作用，眼表菌群的穩(wěn)定對眼表健康的維持起著重要作用。在環(huán)境因素、病理狀態(tài)(如干眼綜合征)、抗生素的使用、感染(如瞼緣炎或結(jié)膜炎)和個人習(xí)慣(如過度地使用隱形眼鏡)、全身疾病(糖尿病或免疫性疾病)等會導(dǎo)致眼表菌群失調(diào)，進一步導(dǎo)致眼表穩(wěn)態(tài)的失衡，引起一系列的眼表疾病，嚴(yán)重威脅眼表健康。因此，眼表菌群平衡的破壞在眼科疾病的發(fā)病機制中起著重要的作用(表1)。這使我們對眼表疾病有了新的認(rèn)識。但目前為止，研究主要集中在各種眼表疾病中眼表菌群的變化，但其因果關(guān)系目前尚未明了。是眼表菌群的變化繼而引起的眼表疾病，還是眼表的疾病引起的菌群變化，需要進一步明確。同時，眼表菌群和眼表疾病的關(guān)系中，眼表菌群的失調(diào)對眼表的作用目前尚未有深入的研究，如是眼表微生物直接對眼表的結(jié)構(gòu)和功能的影響，還是眼表微生物的代謝產(chǎn)物的變化引起的。

表1 眼表菌群與眼表疾病的關(guān)系Table 1 Corelation of the ocular surface microbiome and ocular surface diseases

深入認(rèn)識眼表菌群與眼表疾病的關(guān)系，對于眼表疾病的治療也有重大的意義。對于感染性眼表疾病，如感染性角膜炎、感染性結(jié)膜炎等，目前主要采用的是廣譜的抗生素，或者敏感的抗生素。但抗生素的應(yīng)用進一步加重了菌群失調(diào)，甚至引起耐藥菌的出現(xiàn)。對于非感染性眼表疾病，如干眼、過敏性結(jié)膜炎等，主要是對癥治療。而在治療過程中進一步破壞眼表菌群的平衡，對眼表的健康造成新的威脅。如何從眼表菌群穩(wěn)態(tài)的角度出發(fā)去治療眼表疾病是一項新的挑戰(zhàn)。在眼表疾病的治療過程中，恢復(fù)失衡的眼表菌群或者調(diào)控眼表菌群的代謝產(chǎn)物都需要深入研究。

同時，當(dāng)前不管是培養(yǎng)法或是基因測序?qū)τ谘郾砑膊≈委熐昂蟮牟蓸佣加胁豢杀苊獾恼`差或是污染的疑慮[10]，不同的眼表疾病的眼表菌群不盡相同，若能透過開發(fā)更多檢測輔助診斷或是眼表功能恢復(fù)與否的判斷能夠為未來眼表菌群研究提供方向。

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