花生接種膠凍樣類芽孢桿菌對土壤微生物群落、氨化細(xì)菌、固氮菌及產(chǎn)量的影響

張愛民， 甄麗娜， 徐業(yè)營， 張雙鳳， 張璐琳

(1.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心 河北保定 071051； 2.博野縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村和水利局 河北保定 071300； 3.河北邢化生態(tài)環(huán)境工程有限公司 河北寧晉 055550)

0 前言

花生是全球種植較廣泛、用途多樣的油料和蛋白作物，也是我國高商品率的主要經(jīng)濟(jì)作物和特色出口農(nóng)作物，綜合加工利用增值明顯，是促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主導(dǎo)作物之一?；ㄉa(chǎn)對維持我國油脂和蛋白質(zhì)的供需平衡，保持社會經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。

河北省花生年均播種面積近650萬畝，總產(chǎn)量1 400 kt，分別占省內(nèi)油料作物的70%和90%以上，是河北省第一大油料作物，播種面積和總產(chǎn)量均占全國花生的10%。由于多年連作，土壤生物肥力下降，土傳病害嚴(yán)重，根際微生物代謝紊亂，直接抑制根的營養(yǎng)吸收和生長，同時也影響根圍土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而在很大程度上影響花生的生長和產(chǎn)量，研究種植區(qū)域接種功能微生物對微生物群系的變化和花生產(chǎn)量的提高具有重要的意義[2]。

膠凍樣類芽孢桿菌K-9菌株是河北大學(xué)從河北省高陽縣玉米根際土壤中分離篩選出的土著微生物菌株，是一種能分解磷鉀礦物的細(xì)菌，還具有分解土壤中硅酸鹽、鋁酸鹽及云母等礦物質(zhì)，釋放鉀、硅、磷等多種營養(yǎng)元素供作物吸收利用，增加作物產(chǎn)量的作用。該菌株作為我國生物肥料生產(chǎn)的一類重要功能菌，用于轉(zhuǎn)化利用土壤中的礦物質(zhì)元素等資源，已在國內(nèi)眾多微生物肥料生產(chǎn)企業(yè)中得到應(yīng)用，對于發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義[3-4]。

本研究以膠凍樣類芽孢桿菌K-9菌株為出發(fā)菌株研制的菌粉為接種劑進(jìn)行花生接種試驗(yàn)，分析在花生不同生育期根際土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌等三大類微生物數(shù)量的變化，重點(diǎn)研究了與土壤氮素相關(guān)的氨化細(xì)菌及固氮菌數(shù)量的變化，在分析影響接種后花生產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，探索出了提高花生產(chǎn)量的施肥措施。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)選在河北省河間市冀宇農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社的花生地，位于北緯38°28″、東經(jīng)116°24″，海拔高度12.1 m，雨季主要集中在7—8月，年降雨量450～900 mm，屬于溫帶半濕潤季風(fēng)氣候區(qū)。供試土壤為沙壤土，試驗(yàn)前0～20 cm土層的基本理化性狀見表1。

表1 供試土壤基本理化性狀

1.1.2 試驗(yàn)肥料

過磷酸鈣，w(P2O5)≥12%，湖北程瑞化學(xué)有限公司；尿素，w(N)≥46%，滄州大化集團(tuán)有限公司；磷酸氫二銨，N-P2O5-K2O=18-46-0，什邡志信化工有限公司；硫酸鉀，w(K2O)≥50%，濟(jì)南邦瑞化工有限公司；膠凍樣類芽孢桿菌K-9菌株菌粉(100億/g，以下簡稱菌粉)，河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心生態(tài)與環(huán)保實(shí)驗(yàn)室研制。

1.1.3 作物

花生：冀農(nóng)08-12，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院國家花生協(xié)作組提供。

1.1.4 培養(yǎng)基

細(xì)菌檢測培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.2～7.4。

放線菌檢測培養(yǎng)基(改良高氏1號培養(yǎng)基)：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水l 000 mL，pH為7.2～7.4。

真菌檢測培養(yǎng)基(馬丁氏培養(yǎng)基)：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂20.0 g，10 g/L孟加拉紅溶液3.3 mL，硫酸鎂0.5 g，自來水1 000 mL，pH為7.0～7.4；使用前每l00 mL培養(yǎng)基中加1 g/L鏈霉素0.3 mL。

固氮菌檢測培養(yǎng)基(無氮培養(yǎng)基)：磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鈣0.1 g，碳酸鈣5.0 g，葡萄糖或甘露醇10.0 g，蒸餾水l 000 mL，pH為7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

花生種植時間為2019年4月24日，收獲日期為9月26日，生育期125 d。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，設(shè)4個處理，以A1處理為對照，每個處理重復(fù)3次，試驗(yàn)各處理的肥料用量見表2。小區(qū)面積為7.5 m2，采用地膜覆蓋種植模式，人工點(diǎn)種，種植密度18 000株/畝。肥料施用方法為底施，即將各種肥料混合均勻后撒施在小區(qū)中，然后翻耕定植花生。整個生育期澆水4次、除草2次。

表2 試驗(yàn)各處理的肥料用量 g/畝

1.2.2 土壤樣品采集

在花生出苗期、開花期、結(jié)莢期和收獲期進(jìn)行土樣采集。采用5點(diǎn)取樣法采集土樣，土層深度為5～20 cm，采集后剔除土樣中的雜物，破碎大土塊，置于通風(fēng)條件下自然風(fēng)干，風(fēng)干后的土壤樣品用研缽磨碎，過1 mm篩子后用塑封袋封閉，于4 ℃下保存待測。

1.2.3 土壤微生物的測定

細(xì)菌、放線菌和真菌采用平板稀釋法[5]進(jìn)行測定，細(xì)菌測定選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌測定選用馬丁氏培養(yǎng)基，放線菌測定選用改良高氏1號培養(yǎng)基。

采用最大可能數(shù)(MPN)法測定土壤樣品中的氨化細(xì)菌，采用無氮培養(yǎng)基法測定固氮菌。

1.2.4 花生收獲期生育性狀及產(chǎn)量的測定

在花生收獲期，分別取A1、A2、A3、A4等4個處理的10穴花生進(jìn)行株高、側(cè)枝長度的測量及莢果數(shù)和產(chǎn)量的測定，其中株高和側(cè)枝長度采用米尺測量，花生風(fēng)干后采用FA1004型天平(上海衡平儀器廠)稱量其質(zhì)量，并采用SPASS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同施肥處理對土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量的影響

分別在花生苗期、開花期和結(jié)莢期，通過平板稀釋法，選用不同的培養(yǎng)基對土壤中的細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量進(jìn)行3次平行測定，測定結(jié)果的平均值見表3。

表3 花生不同生育期土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量測定結(jié)果的平均值

從表3可以看出，土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，達(dá)到108數(shù)量級；放線菌數(shù)量次之，為106數(shù)量級；真菌數(shù)量最少。

花生生育期從苗期到開花期，細(xì)菌的繁殖呈現(xiàn)上升趨勢，到結(jié)莢期則出現(xiàn)下降。施用膠凍樣類芽孢桿菌處理的細(xì)菌數(shù)量與A1處理的相比均有不同程度的增加，其中A4處理的在苗期增加17.0%，開花期達(dá)到最大為25.6%，到結(jié)莢期又略有下降。放線菌數(shù)量的變化與細(xì)菌的相同，與A1處理的相比，A4處理的放線菌數(shù)量在苗期增加7.2%，開花期達(dá)到最大為18.7%，到結(jié)莢期又略有下降。土壤中的真菌與細(xì)菌、放線菌不同，隨花生生育期的延長，3個時期的真菌數(shù)量均表現(xiàn)出A2>A4>A3，A3處理的真菌數(shù)量最少，可能與膠凍樣類芽孢桿菌對土壤病原微生物具有抑制作用有關(guān)，而土壤中的致病微生物大多為真菌[6-7]。

2.2 不同施肥處理對土壤固氮菌和氨化細(xì)菌數(shù)量的影響

在花生的不同生育期采集土樣，通過平板稀釋法，采用氨化細(xì)菌的檢測方法對土壤中的氨化細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行分析，同時選用固氮菌培養(yǎng)基對土壤中固氮菌數(shù)量進(jìn)行測定，結(jié)果見表4(其中“+”表示可檢測出，“-”表示未檢出)和表5。

表4 花生不同生育期土壤中氨化細(xì)菌測定結(jié)果

表5 花生不同生育期土壤中固氮菌測定結(jié)果 cfu/g

氨化作用在土壤氮素礦化中起到了決定性作用，其強(qiáng)度的變化在一定程度上反映了土壤供氮能力[8-9]。由表4可知，花生在苗期和開花期，A1處理檢測不出氨化細(xì)菌，到花生結(jié)莢期可以檢測出氨化細(xì)菌；而A4處理從花生苗期到收獲期，均可檢測出氨化細(xì)菌，可能是菌粉接種量大，誘導(dǎo)了土壤中氨化細(xì)菌的活動，機(jī)理還有待研究。由于氨化細(xì)菌檢測只進(jìn)行了定性分析，無定量的比較，所以各處理間無法進(jìn)行數(shù)量的統(tǒng)計。

2.3 收獲期花生生育性狀調(diào)查及考種

花生收獲時，首先在A1、A2、A3、A4等 4個處理中選取相同的位置取10穴花生，進(jìn)行產(chǎn)量測定，同時進(jìn)行考種，然后通過SPASS軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計分析。不同施肥處理的花生生育性狀及產(chǎn)量測定結(jié)果見表6。

表6 不同施肥處理的花生生育性狀及產(chǎn)量測定結(jié)果

由表6可知，A1、A2和A4處理的花生株高、側(cè)枝長度和產(chǎn)量均呈現(xiàn)遞增趨勢，A3處理的側(cè)枝長度略短，A4表現(xiàn)最好，4個處理的花生單株莢果數(shù)基本無差異。進(jìn)一步通過SPASS軟件進(jìn)行花生株高、側(cè)枝長度、單株莢果數(shù)及產(chǎn)量的顯著性分析，差異顯著性(P顯著性)依次為0.838、0.990、0.172、0.902，均大于P(P=0.05)，說明處理間無顯著性差異，表明通過減少過磷酸鈣及硫酸鉀的用量、增加菌粉的用量可以達(dá)到花生增產(chǎn)的效果。畝施菌粉200 g同時每畝減少5 kg過磷酸鈣和1 kg硫酸鉀用量的A2處理的花生產(chǎn)量與A1處理的相比，無顯著差異，說明畝施菌粉200 g與畝施5 kg過磷酸鈣和1 kg硫酸鉀具有等效性。進(jìn)一步提高菌粉接種量同時減少化肥用量，A4處理的花生產(chǎn)量與A1處理的相比增產(chǎn)46.4 kg，進(jìn)一步證明了施用膠凍樣類芽孢桿菌具有增產(chǎn)效果，可減少化肥用量。

2.4 經(jīng)濟(jì)效益分析

花生收獲后，按尿素2 650元/t、磷酸氫二銨3 600元/t、過磷酸鈣700元/t、硫酸鉀4 250元/t、花生4.4元/kg、菌粉40元/kg計，進(jìn)行經(jīng)濟(jì)效益分析，結(jié)果見表7。

由表7可知：A2、A3、A4處理與A1處理比較，畝新增純利潤分別為130.87、165.86、214.91元，表明逐漸減少化肥用量的同時增加菌粉用量，畝產(chǎn)量和產(chǎn)值呈上升趨勢；A4處理表現(xiàn)最佳，與A1處理相比，花生產(chǎn)量提高了12.24%，純利潤增加了214.91元/畝；施用菌粉可以作為花生減施化肥的基本措施，即畝施用菌粉400 g，在不減少尿素及磷酸二銨用量的前提下，過磷酸鈣和硫酸鉀的用量減少50%，可以達(dá)到理想的增產(chǎn)效果。

表7 經(jīng)濟(jì)效益分析一覽表

3 結(jié)語

本研究表明，膠凍樣類芽孢桿菌作為花生接種劑對于減少化肥用量、提高花生產(chǎn)量具有一定的積極作用。由于試驗(yàn)地塊單一，膠凍樣類芽孢桿菌的大田應(yīng)用試驗(yàn)效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證，其對根際有益菌群增加的機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。