METTL14 在CML 細(xì)胞中的表達(dá)及其與PKM 剪接體間的相關(guān)性分析

廖志華，劉靜，李書琪，姚芳苡，黃波，章海斌，張靜，王小中

（1．江西省婦幼保健院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2．江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006）

慢性髓性白血病 （chronic myeloid leukemia,CML）是造血干細(xì)胞水平發(fā)生的惡性骨髓增殖性疾病[1]。伊馬替尼（Imatinib，IM）是目前CML 治療的首選藥物，顯著改善了CML 的預(yù)后，然而約20%患者伴隨出現(xiàn)的化療耐藥已成為其治療的最主要障礙[2]。 目前，針對(duì)CML 的IM 耐藥機(jī)制研究主要有BCR/ABL 過度表達(dá)和點(diǎn)突變[3]、下游信號(hào)通路異常[4]、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)藥物外排[5]以及CML 干細(xì)胞[6]等，以這些理論為指導(dǎo)的耐藥治療手段在臨床上難以達(dá)到滿意的療效。

RNA 表觀遺傳學(xué)中N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾是一種通過影響mRNA 剪切、穩(wěn)定、翻譯等過程改變細(xì)胞正常的分化途徑,可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和藥物反應(yīng)的改變。 多項(xiàng)研究報(bào)道，m6A 與肺癌[7]、肝癌[8]等實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是腫瘤近年研究領(lǐng)域的新方向， 而有關(guān)其與CML 的研究鮮有報(bào)道。 因此，本項(xiàng)目分析m6A 修飾酶METTL14 在不同時(shí)期CML 細(xì)胞中的差異表達(dá)， 以期通過甲基化的思路來闡明CML 耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及試劑

1.1.1 臨床標(biāo)本 根據(jù)《慢性髓性白血病中國診斷與治療指南(2020年版)》[9]作為CML 診斷標(biāo)準(zhǔn)。 選取本課題組前期實(shí)驗(yàn)已保存的同一份標(biāo)本[10]，繼續(xù)收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院首次就診的門診患者標(biāo)本，IM 敏感的CML 樣本30 例和IM 耐藥的CML 標(biāo)本10 例。 所有標(biāo)本的使用均符合南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理要求。

1.1.2 試劑 伊馬替尼 （Imatinib，IM） 購自Sigma Aldrich 公司，PrimeScriptTM RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara 公司，熒光定量PCR 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA 測(cè)序 從納入研究的樣本中提取總RNA 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估、純化和完整性分析，測(cè)序文庫的構(gòu)建，所有文庫都是按要求自備并通過Illumina Nextseq 500 系統(tǒng)分析150 nt paired-end sequencing。 測(cè)序委托武漢生命之美生物有限公司進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 檢測(cè)METTL14 mRNA 表達(dá) METTL14 和GAPDH 引物是根據(jù)GeneBank 中基因序列人工設(shè)計(jì)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成相應(yīng)引物序列，見表1。

表1 PCR 反應(yīng)引物序列

反應(yīng)參數(shù)： 95℃30 s 熱啟動(dòng)；95℃5 s 、60℃退火34 s，70℃30 s， 共40 個(gè)循環(huán)。 在ABI7500 qPCR 儀采集熒光信號(hào)后以7 500 System Software v2.0.6 分析，閾值線一般設(shè)置在較低熒光信號(hào)的指數(shù)擴(kuò)增期。結(jié)果分析： 觀察擴(kuò)增曲線效果， 利用ΔΔCt 法計(jì)算METTL14 的相對(duì)表達(dá)量， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 計(jì)算公式： 基因相對(duì)表達(dá)量= 2-ΔΔCt；ΔΔCt =(Ct目的-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對(duì)照組

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 22.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析CML 不同類型樣本間差異表達(dá)基因 我們將同一類型的5 個(gè)樣本作為實(shí)驗(yàn)重復(fù)， 樣本間兩兩一組進(jìn)行比較， 得到圖中紅色的點(diǎn)表示顯著差異表達(dá)基因（DEG）。edgeR 是一款專門針對(duì)基因表達(dá)量做差異表達(dá)分析的軟件， 分析結(jié)果以fold change（即FC≥2 或≤0.5, p-value≤0.01）來判斷一個(gè)基因是否差異表達(dá)，見圖1。 急變期CML 與正常對(duì)照組相比具有更多紅色的點(diǎn)表示相對(duì)于慢性期CML，急變期CML 基因表達(dá)具有很大差異。。

圖1 edgeR 方法鑒定CML 不同類型標(biāo)本間差異表達(dá)基因

2.2 功能通路分析顯示剪接體信號(hào)通路在CML 急變期中有關(guān)鍵作用 利用測(cè)序數(shù)據(jù)，通過對(duì)樣本可變剪接差異分析進(jìn)行組間重疊分析， 發(fā)現(xiàn)急變期CML 特異的可變剪接水平發(fā)生顯著差異的基因最顯著富集的通路是剪接體（Spliceosome）。對(duì)三種類型的樣本，每?jī)煞N之間進(jìn)行比較，對(duì)獲得的可變剪接水平發(fā)生顯著差異的基因進(jìn)行KEGG pathway富集性分析，結(jié)果如下：無論與正常樣本還是慢性期樣本相比， 急變期最顯著富集的是仍剪接體功能通路（P=7.38E-06），見圖2。

圖2 KEGG pathway 富集性分析顯示剪接體信號(hào)通路在CML 急變中有關(guān)鍵作用

2.3 RNA 測(cè)序結(jié)果中METTL14 在不同類型樣本間的表達(dá)變化 RNA 甲基化酶METTL14 參與多個(gè)基因的剪接過程。 本課題組將健康對(duì)照、IM 敏感CML 慢性期、IM 耐藥CML 急變期患者骨髓或外周血標(biāo)本各5 份進(jìn)行RNA-Seq， 分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與敏感組標(biāo)本相比， 耐藥組標(biāo)本中METTL14 表達(dá)明顯升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028），與對(duì)照組相比，耐藥組METTL14 表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.001），見圖3。

圖3 METTL14 在不同組CML 標(biāo)本表達(dá)變化

2.4 臨床標(biāo)本驗(yàn)證METTL14 在不同類型樣本間的差異表達(dá) 將前期實(shí)驗(yàn)已保存的IM 敏感和耐藥患者及后期收集共40 例樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證，同樣發(fā)現(xiàn)與敏感組相比，耐藥組METTL14 mRNA 水平明顯升高（P<0.01）；與對(duì)照組相比，METTL14 均顯著低表達(dá)（P<0.001），即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)一致性，見圖4。

圖4 熒光定量PCR 檢測(cè)CML 標(biāo)本中METTL14 mRNA 水平

2.5 METTL14 mRNA 與PKM2/PKM1 的 相 關(guān) 性本課題組前期實(shí)驗(yàn)已分析PKM 剪接體在IM 敏感及耐藥慢粒細(xì)胞中的差異表達(dá)并已發(fā)表相關(guān)論文[10]，采用Spearman 法分析來自同一份CML 標(biāo)本中METTL14 mRNA 和PKM 剪接異構(gòu)體表達(dá)量的關(guān)系，相關(guān)分析表明METTL14 mRNA 表達(dá)水平與PKM2/PKM1 比值呈正相關(guān)（r=0.495，P=0.005），見圖5。

圖5 Spearman 分析METTL14 水平與PKM2/PKM1 相關(guān)性

2.6 SRAMP 網(wǎng)址預(yù)測(cè)PKM 基因的m6A 修飾位點(diǎn)利用在線工具SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）得到PKM 基因的m6A 峰區(qū)域序列中所有潛在的m6A 位點(diǎn)信息。 圖中可以看到m6A 位點(diǎn)涉及的motif（用藍(lán)色標(biāo)記）和可信度，SRAMP 網(wǎng)站提供了幾個(gè)閾值：99%/95%/90%/85%，分別對(duì)應(yīng)very high/high/moderate/low 的自信度。 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PKM基因第9 外顯子序列中有多個(gè)m6A 峰超過90%的可信度，見圖6。

圖6 PKM 在mRNA 水平上的m6A 峰區(qū)域序列分布

3 討論

慢性髓性白血病（CML）是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病， 其藥物耐受已成為CML 治療的主要障礙，闡明耐藥機(jī)制亟待突破。 已知m6A 修飾對(duì)細(xì)胞凋亡、免疫耐受、小鼠胚胎發(fā)育等都具有重要調(diào)控作用，其中METTL14 作為m6A甲基化主要的甲基化酶之一， 參與多種腫瘤的惡性表型調(diào)控[6-7,11]，但其在CML 發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道并不多。

我們的研究將IM 敏感CML 慢性期、IM 耐藥急變期患者和健康對(duì)照個(gè)體的全血標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，IM 敏感組和耐藥組CML 細(xì)胞中METTL14 mRNA 表達(dá)均降低，但與IM 敏感患者相比， 耐藥患者體內(nèi)RNA 甲基化酶METTL14 mRNA 處于明顯的高水平，并且這在后續(xù)40 例臨床樣本中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，提示測(cè)序結(jié)果的可靠性，且METTL14 在CML 耐藥中發(fā)揮重要作用；研究報(bào)道[14]，METTL14 的沉默促進(jìn)正常造血干/祖細(xì)胞分化，并抑制AML 細(xì)胞存活/增殖，主要通過m6A 修飾調(diào)節(jié)其mRNA 靶標(biāo)如MYB 和MYC 發(fā)揮其致癌作用，這與我們的研究結(jié)果類似。然而，METTL3 介導(dǎo)的m6A 甲基化調(diào)控lncRNA NEAT1 通過miR-766-5p/CDKN1A 軸促進(jìn)CML進(jìn)展[13]，且這種現(xiàn)象由RNA 甲基化酶METTL3 低表達(dá)所致。 Yan F 等[12]的研究顯示，CML 患者在接受TKIs 治療后， 僅去甲基化酶FTO 表達(dá)會(huì)升高，并在誘導(dǎo)TKIs 耐受和疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要驅(qū)動(dòng)作用，提示不同的RNA 甲基化酶介導(dǎo)的m6A 修飾在促進(jìn)白血病發(fā)生的機(jī)制中可能發(fā)揮不同作用。

我們課題組前期在進(jìn)行“丙酮酸激酶M（pyruvate kinase M, PKM） 剪接體在伊馬替尼敏感及耐藥CML 細(xì)胞中的差異表達(dá)”課題研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，PKM基因在耐藥CML 細(xì)胞中發(fā)生異常選擇性剪接傾向于生成更多的PKM2， 導(dǎo)致PKM2/PKM1 比值升高，并且這與CML 伊馬替尼耐藥相關(guān)[10]，但異常剪接機(jī)制未明。 Spearman 法分析發(fā)現(xiàn)， 來自同一份CML 標(biāo)本中METTL14 和PKM 剪接異構(gòu)體mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，即耐藥患者中METTL14 高表達(dá)的患者PKM2/PKM1 比值更高， 說明METTL14 差異表達(dá)與PKM 異常剪接密切相關(guān)。 中科院北京基因組研究所楊運(yùn)桂課題組早期研究已明確證實(shí)，m6A 甲基化修飾能調(diào)控RNA 的選擇性剪接[15]。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)某些基因的mRNA 前體在剪接時(shí)，其剪接位點(diǎn)的選擇性受到RNA 甲基化表觀遺傳學(xué)的影響[16-17]。

為了揭示PKM 基因的異常剪接機(jī)制，我們利用在線工具SRAMP 網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)， 在PKM 基因外顯子9 區(qū)域存在豐富的m6A 修飾位點(diǎn)。 PKM 在mRNA 水平可能受METTL14 介導(dǎo)的m6A 甲基化所調(diào)控， 具體涉及的機(jī)制可能是高水平的METTL14 介導(dǎo)PKM 剪接位點(diǎn)發(fā)生高度甲基化，使其剪接位點(diǎn)不能被剪接體所識(shí)別， 導(dǎo)致外顯子9 不能被剪接， 迫使剪接體與外顯子10 處剪接位點(diǎn)結(jié)合，最終導(dǎo)致外顯子10 被剪接，即PKM2 生成增加，PKM1 生成減少，增加PKM2 的生成，從而導(dǎo)致CML 耐藥的形成。 這有助于我們從m6A 角度來闡述CML 耐藥機(jī)制，也為尋找CML 耐藥的潛在治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)和參考依據(jù)。