采供血機(jī)構(gòu)血液HBV 篩查策略改進(jìn)的探討

陳丹，王芳，張鵬飛，郭新宇，莊養(yǎng)林

(1.江西省職業(yè)病防治研究院檢驗科；2.江西省血液中心檢驗科，江西 南昌 330006)

為減少經(jīng)血傳播病毒風(fēng)險， 我國所有采供血機(jī)構(gòu)在原有血清學(xué)試劑檢測病毒感染標(biāo)志物的基礎(chǔ)上，全面增加病毒核酸檢測已有5年余，有效降低了乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及艾滋病病毒（HIV）經(jīng)血傳播風(fēng)險[1-4]。為進(jìn)一步提升血液安全水平，國家衛(wèi)生健康委也印發(fā)了《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019 版）》，其中4.2.4 檢測策略中指出：HIV、HBV 和HCV 感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各進(jìn)行1 次檢測[5]。 目前本地區(qū)血液篩查模式為1 次核酸檢測加2 種血清學(xué)試劑檢測， 此檢測模式具體為2 種血清學(xué)試劑檢測結(jié)果為陰性情況下， 即實驗樣本吸光度值/臨界值（Sample optical density/Cut-off，S/CO） 小于臨界值（cut-off）時，再使用羅氏公司血液篩查核酸試劑進(jìn)行病毒核酸檢測。 而在血液篩查過程中，工作人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)2 種血清學(xué)試劑檢測結(jié)果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間時， 根據(jù)試劑判定規(guī)則，此類標(biāo)本血清學(xué)檢測結(jié)果會被判定為陰性， 將直接進(jìn)行核酸檢測， 但羅氏核酸檢測模式6 混樣檢測取樣量較少（每人份167 μL），若檢測樣本中HBV DNA 濃度較低， 吸取到病毒顆粒進(jìn)行擴(kuò)增概率大為降低，容易造成病毒漏檢，從而造成乙肝病毒經(jīng)血傳播的可能。 在發(fā)現(xiàn)了上述情況后，本實驗室及時優(yōu)化了相關(guān)檢測策略，現(xiàn)將有關(guān)工作介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選自2018年1月1日至2020年12月31日南昌地區(qū)221 191 份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本。

1.2 主要儀器 瑞士哈密爾頓全自動酶免檢測儀FAME， 羅氏公司COBAS s 201 核酸檢測系統(tǒng)，瑞士Hamlton 全自動STAR 加樣儀， 長沙湘麓DL-6M 大容量低溫離心機(jī)。

1.3 主要試劑 核酸檢測試劑盒：COBAS TaqScreen MPX V2.0 test 核酸檢測試劑盒 （瑞士Roche 公司，批號：215559、232401 等），該試劑可同時定性檢測人類血漿中的HIV-1,2 RNA、HCV RNA 和HBV DNA；HBsAg 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（廈門新創(chuàng)生物科技有限公司、北京萬泰生物藥業(yè)有限公司， 批號：2019115136、2019095125、B20191141、B20190932 等）。

1.4 實驗方法 對無償獻(xiàn)血標(biāo)本進(jìn)行2 種血清學(xué)試劑檢測乙肝表面抗原（HBsAg），對HBsAg 檢測結(jié)果均為陰性的標(biāo)本 （包括初次檢測反應(yīng)性復(fù)查為陰性的標(biāo)本）進(jìn)行核酸檢測。

1.4.1 對2 種HBsAg 血清學(xué)試劑檢測S/CO 均小于50% cut-off 或1 種血清學(xué)試劑檢測S/CO 在50%～80% cut-off 的標(biāo)本（以下稱常規(guī)核酸檢測標(biāo)本） 按常規(guī)核酸檢測方式進(jìn)行檢測， 即在全自動STAR 加樣儀上先匯集6 人份血清學(xué)試劑檢測結(jié)果為陰性的血清（每人份167 μL）到1 管（共匯集1 mL）中進(jìn)行6 混樣檢測（以下稱PP6），若檢測結(jié)果為陰性則代表此6 人份樣本核酸檢測結(jié)果為陰性，若檢測結(jié)果為反應(yīng)性，則需對此6 人份樣本進(jìn)行拆分/單檢（以下稱PP1）（1 mL），以明確哪一人份血清為HBV DNA 反應(yīng)性。統(tǒng)計PP6 反應(yīng)性循環(huán)閾值（Cycle threshold values，Ct 值）和PP1 反應(yīng)性Ct 值、HBV DNA 陽性率、拆分成功率。

1.4.2 對2 種HBsAg 血清學(xué)試劑檢測S/CO 均在50%～80% cut-off 的標(biāo)本，直接進(jìn)行PP1 檢測。 統(tǒng)計PP1 反應(yīng)性Ct 值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計算各組Ct 值均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）及拆分成功率，運(yùn)用SPSS 10.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間Ct 值比較采用t 檢驗， 各組陽性率比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2018年至2020年P(guān)P6 反應(yīng)性Ct 值中位數(shù)分別為37.8、37.5、37.3 ， 三年P(guān)P6 檢測Ct 值兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 2018年至2020年P(guān)P6 Ct 值比較

2.2 2018年至2020年P(guān)P6 Ct 值在37.1 以上時，其PP1 檢測結(jié)果為陽性的情況分別為52.13%（49/94）、38.78%（19/49）、46.39%（45/97），2018年至2020年P(guān)P6 Ct 值在37.0 以下時，其PP1 檢測結(jié)果為陽性的情況分別為86.67%（26/30）、76.92%（20/26）、70.77%（46/65），其中2018年至2020年P(guān)P6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2，PP6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下其PP1 檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 2018年至2020年P(guān)P6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下比較

表3 2018年至2020年P(guān)P6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下其PP1 檢測陽性率比較

2.3 兩種HBsAg 血清學(xué)檢測S/CO 均在50%～80%cut-off 的標(biāo)本，直接進(jìn)行PP1 檢測結(jié)果。三年兩種HBsAg 血清學(xué)檢測S/CO 均在50%～80%cut-off的標(biāo)本共收集15 份，PP1 檢測均為反應(yīng)性。三年此類標(biāo)本PP1 檢測Ct 值均值分別為35.23、37.04、34.08，此類標(biāo)本PP1 檢測Ct 值在36.0 以上標(biāo)本占比此類PP1 檢測總數(shù)的53.33%， 顯示這類標(biāo)本多數(shù)HBV DNA 濃度處于較低水平， 其中2019年標(biāo)本9 和標(biāo)本10 的PP1 檢測Ct 值達(dá)到40.7 和38.8，見表4，在另行的PP6 檢測中，標(biāo)本4、6、10、11 檢測為無反應(yīng)性，PP6 檢測Ct 值與PP1 檢測Ct值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 2018年至2020年S/CO 均在50%～80%cut-off 的標(biāo)本檢測結(jié)果

3 討論

在國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)采用羅氏MPX V2.0 試劑進(jìn)行血液篩查時， 都是對無償獻(xiàn)血標(biāo)本進(jìn)行2 種血清學(xué)試劑檢測HBsAg 結(jié)果均為陰性的標(biāo)本行核酸檢測， 即先匯集6 人份血清學(xué)試劑檢測結(jié)果為陰性的血漿 （每人份167 μL） 到1 管 （共匯集1 mL）中進(jìn)行PP6 檢測，若此管檢測結(jié)果為陰性則代表此6 人份樣本核酸檢測結(jié)果為陰性， 若檢測結(jié)果為反應(yīng)性， 則需對此6 人份樣本分別進(jìn)行PP1檢測，以拆出具體哪一人份血清為HBV DNA 反應(yīng)性。 但PP6 反應(yīng)性標(biāo)本大多數(shù)經(jīng)證實為OBI 獻(xiàn)血者或處于血清學(xué)檢測窗口期， 此類標(biāo)本HBsAg 往往檢測為陰性，病毒載量往往較低[6]，若標(biāo)本病毒載量低于核酸試劑混樣檢測下限， 其PP6 檢測很大概率檢測為無反應(yīng)性。

從近三年常規(guī)核酸檢測標(biāo)本PP6 檢測Ct 值、PP1 檢測Ct 值及PP6 反應(yīng)性進(jìn)一步拆分成功率統(tǒng)計結(jié)果來看，PP6 Ct 值在37.0 以下時，其拆分檢測PP1 結(jié)果為陽性的情況分別在86.67%（26/30）、76.92%（20/26）、70.77%（46/65），其中PP6 Ct 值在35.0 以下時， 三年P(guān)P1 檢測結(jié)果為陽性均為100%。PP6 Ct 值區(qū)間在35.1～36.0 時，2020年常規(guī)核酸檢測出現(xiàn)了兩次PP6 Ct 值為35.9 和36.0，而PP1 檢測結(jié)果為陰性的情況，故2020年P(guān)P6 Ct 值在35.1～36.0 之間的標(biāo)本PP1 拆分成功率僅在78%。另外除2018年，其余兩年P(guān)P1 檢測陽性率均低于Wang 等[7]報道的PP6 Ct 值小于等于37.0 時拆分陽性率為80%， 這可能與檢測試劑或常年進(jìn)行核酸篩查有關(guān)：Wang 等 進(jìn)行PP6 檢測所用試劑為羅氏一代試劑MPX， 而本文所用試劑為二代試劑MPX V2.0， 兩種試劑特異性及靈敏度均存在差異， 另一個原因可能與長期進(jìn)行血液核酸篩查，HBsAg-/HBV DNA+高病毒載量的標(biāo)本已篩出，近幾年血液篩查標(biāo)本以低病毒載量為主。 這從PP6 反應(yīng)性標(biāo)本多數(shù)處在Ct 值為36.1～39.0 之間，2018年至2020年此區(qū)間標(biāo)本分別占比PP6 反應(yīng)性總數(shù)的70.97%、73.33%和74.69%。曾勁峰等[8]通過確證實驗得出，25 例HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本病毒載量介于不可檢出到至108.9 IU/mL， 歐山海等[9]對62 例HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中93.5%（58/62）的HBV DNA 是小于100 IU/mL。 因此對HBsAg-/HBV DNA+進(jìn)行PP6 檢測，應(yīng)慎之又慎，蔣瑞馨等[10]建議當(dāng)PP6 Ct 值≤37 時可考慮重復(fù)PP1 檢測。

在日常檢測中， 工作人員發(fā)現(xiàn)個別PP6 反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行PP1 檢測時呈反應(yīng)性， 同時查閱血清學(xué)檢測過程， 發(fā)現(xiàn)其2 種血清學(xué)試劑檢測結(jié)果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間， 然而根據(jù)試劑說明書規(guī)則， 此類標(biāo)本血清學(xué)檢測結(jié)果會判定為陰性，按照篩查策略將此類標(biāo)本進(jìn)行PP6 檢測，恰巧PP6 檢測呈反應(yīng)性。 鑒于目前進(jìn)入PP6 檢測的標(biāo)本以低HBV DNA 載量標(biāo)本為主，因此工作人員對待此類標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA 檢測開始謹(jǐn)慎起來， 因?qū)⒋祟悩?biāo)本進(jìn)行PP6 檢測， 能否檢出HBV DNA 是個疑問。 為降低因HBV DNA 載量過低而超出核酸試劑檢測下限，造成病毒漏檢的風(fēng)險，本實驗室調(diào)整了檢測策略， 即將2 種血清學(xué)試劑檢測結(jié)果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間的標(biāo)本直接進(jìn)行PP1 檢測。 根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果， 此類標(biāo)本PP1 檢測Ct 值在36.0 以上標(biāo)本占比此類PP1 檢測總數(shù)的53.33%， 顯示這類標(biāo)本多數(shù)HBV DNA濃度處于較低水平。 以常規(guī)PP1 檢測反應(yīng)性Ct 值在36.0 以上，其對應(yīng)的PP6 反應(yīng)性Ct 值應(yīng)在37.1以上， 而近三年P(guān)P6 Ct 值在37.1 以上時， 其PP1檢測結(jié)果為陽性的情況分別為52.13%（49/94）、38.78%（19/49）、46.39%（45/97）， 表現(xiàn)為較低的拆出陽性率。 其中2019年標(biāo)本9 和標(biāo)本10 的PP1檢測Ct 值達(dá)到40.7 和38.8，以及在另行的PP6 檢測中，標(biāo)本4、6、10、11 檢測為無反應(yīng)性，此種情況更加印證了我們將2 種血清學(xué)試劑檢測結(jié)果S/CO同時處在50%～80% cut-off 之間的標(biāo)本，由PP6 檢測調(diào)整為直接進(jìn)行PP1 檢測的必要。

目前羅氏血液篩查模式未有改變， 出于對進(jìn)入核酸檢測的標(biāo)本均為2 遍血清學(xué)檢測為陰性結(jié)果及檢測成本因素的考慮， 我國采供血機(jī)構(gòu)采用羅氏MPX V2.0 進(jìn)行血液篩查仍是PP6 模式，未直接采用PP1 的模式， 但2 種血清學(xué)試劑檢測結(jié)果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間的標(biāo)本對于此種模式仍是挑戰(zhàn)。 此類標(biāo)本若采用羅氏既定的篩查模式，一種結(jié)果是混樣結(jié)果陰性，標(biāo)本放行，即病毒漏檢。 另一種結(jié)果是混樣陽性進(jìn)入PP1 檢測，即增加10 份核酸試劑用于PP1 檢測。 為兼顧檢測成本及降低傳染風(fēng)險，讓此類標(biāo)本單獨(dú)成為1個pool 即可在PP6 模式下對此份標(biāo)本進(jìn)行PP1 檢測，節(jié)約10 份用于PP1 檢測的核酸試劑（以本實驗室2018年至2020年數(shù)據(jù)統(tǒng)計可節(jié)約150 份核酸試劑，約4.5 萬元），按此種篩查模式在現(xiàn)行的檢測策略中既能更好地降低乙肝病毒經(jīng)血傳播風(fēng)險，又可以節(jié)約檢測成本。