半枝蓮多糖通過mTOR/P70S6K 通路對宮頸癌U14荷瘤小鼠的腫瘤抑制及誘導(dǎo)凋亡作用研究

高冬冬，張靜，何苗

（1.駐馬店市中心醫(yī)院腫瘤一科，河南 駐馬店 463000；2.駐馬店市黃淮學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 駐馬店 463000）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤， 發(fā)病高峰為45～50 歲， 近年來發(fā)病年齡有逐漸下降趨勢，嚴重威脅女性生命健康。 宮頸癌病因復(fù)雜，早期無明顯癥狀，出現(xiàn)相應(yīng)癥狀時已發(fā)展到中晚期，目前認為人乳頭瘤狀病毒 （human papillomavirus，HPV）感染是主要致病因素，HPV 疫苗可預(yù)防相關(guān)高危型HPV 感染，但價格昂貴，限制其廣泛應(yīng)用。臨床治療宮頸癌主要依靠手術(shù)和放化療， 患者通過治療，可在一定程度延長生存期，同時不可避免出現(xiàn)副作用，影響患者繼續(xù)治療，因此開發(fā)低廉、安全、 有效的藥物對提高患者生存質(zhì)量具有重要意義[1]。 半枝蓮是傳統(tǒng)中藥，有清熱解毒、活血化瘀、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，主治療瘡腫毒、跌打損傷及水腫等。 研究顯示，半枝蓮對胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤具有良好抑瘤作用[2]。 多糖是一種天然大分子物質(zhì)，其抗腫瘤生物活性已被證實[3]。 半枝蓮多糖是半枝蓮主要有效活性成分之一， 含有鼠李糖、半乳糖、甘露糖等，在宮頸癌中表現(xiàn)出明顯抗腫瘤作用[4]。 但目前關(guān)于半枝蓮多糖的抗腫瘤機制尚不明確，鑒于此，本研究通過建立宮頸癌荷瘤小鼠模型， 探討半枝蓮多糖抗腫瘤作用及其可能機制，為發(fā)掘中藥治療宮頸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系和實驗動物 小鼠宮頸癌U14 細胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所。

SPF 級BALA/c 雌鼠65 只，4～5 周齡， 體質(zhì)量18～20 g， 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2017-0011]。 購入后SPF 環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 主要試劑和儀器 半枝蓮多糖（30%）購自西安天康生物科技有限公司，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA） 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，兔抗小鼠雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 單抗、p-pmTOR 單抗、B細胞淋巴瘤-2 （B cell lymphoma-2，Bcl-2） 單抗、Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白 （Bcl-2 associated X protein，Bax）單抗購自美國Abcam 公司，兔抗P70 核糖體蛋 白S6 激 酶 （P70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）多抗購自美國Sant Cruze 公司，大鼠抗小鼠p-p70S6K 單抗購自美國Cell Signaling 公司，電泳儀購自美國BIO-RAD 公司。

1.3 建立荷瘤小鼠模型 建立荷瘤小鼠模型[5]：取對數(shù)增殖期U14 細胞，0.25%胰酶消化，PBS 洗滌后， 生理鹽水調(diào)整細胞濃度為5×106個/mL 備用。隨機抽取5 只小鼠，按0.1 mL/只腹腔接種U14 細胞， 正常飼養(yǎng)7～10 d 可見小鼠腹部隆起， 腹水增加，表明U14 腹水小鼠模型建立成功。 處死小鼠，無菌抽取腹水， 生理鹽水稀釋細胞濃度為2×106個/mL。 取60 只小鼠， 按0.1 mL/只接種于左前腋下，接種后4 d，可見腫瘤包塊，接種率100%。

1.4 分組及治療 將接種成功小鼠隨機分為模型組、LPA 組、半枝蓮組、半枝蓮+LPA 組，每組各15只。接種成功后24 h 后進行治療，半枝蓮組灌胃半枝蓮多糖3 g/kg（生理鹽水溶解），1 次/d，連續(xù)14 d，末次灌胃同時尾靜脈注射與LPA 組等量PBS；LPA組小鼠灌胃與半枝蓮組等量生理鹽水，1 次/d，連續(xù)14 d，末次灌胃同時尾靜脈注射1 mg/kg 的LPA（PBS 溶解）；半枝蓮+LPA 組小鼠灌胃半枝蓮和尾靜脈注射LPA； 模型組小鼠灌胃生理鹽水和尾靜脈注射PBS。

1.5 測量腫瘤大小 治療當天開始，觀察小鼠活動情況，精神狀態(tài)及腫瘤生長情況，每隔1 d，使用游標卡尺測量對腫瘤長徑（a）和短徑（b）進行測量，根據(jù)公式計算腫瘤體積（V），V=a×b2/2，繪制腫瘤生長曲線。

1.6 檢測抑瘤率 末次治療后24 h， 處死小鼠，無菌分離各組小鼠腋下腫瘤，電子天平稱重，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量）×100%。

1.7 檢測腫瘤組織細胞凋亡和細胞周期 每組隨機取5 只小鼠腫瘤組織， 制備腫瘤組織懸液，300目濾網(wǎng)過濾， 離心洗滌3 次， 調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，放入預(yù)冷的70%乙醇中4 ℃固定12 h，離心棄上清液， 預(yù)冷PBS 重懸細胞后， 加入RNA酶（Rnase）PI 染色液37 ℃避光染色30 min，之后再流式細胞儀激發(fā)波長488 nm 處檢測，檢測腫瘤細胞凋亡情況和細胞周期。

1.8 HE 染色觀察腫瘤組織組織學(xué)變化 稱重后，每組隨機取5 只小鼠腫瘤組織放置于10%中性甲醛中，4 ℃固定48 h，梯度濃液乙醇對組織脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機切片，片厚約4 μm，常規(guī)蘇木素、伊紅染色，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織學(xué)形態(tài)。

1.9 免疫組化檢測腫瘤組織Bax 和Bcl-2 表達 取腫瘤組織切片，脫蠟水化后，PBS 沖洗；放入枸櫞酸鈉緩沖液15 min 進行抗原修復(fù)，PBS 沖洗； 加入3% H2O2室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；加入50 μL 樣品血清室溫孵育15 min；加入兔抗小鼠Bax 和Bcl-2 一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌；DAB 顯色； 蘇木素復(fù)染，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果， 每張切片隨機選取5 個視野，計算陽性表達率，陽性表達率（%）=陽性表達細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.10 Western blot 檢測腫瘤組織mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表達 各組剩余腫瘤組織保存于液氮中， 取100 mg 液氮中保存腫瘤組織，加入RIPA 液裂解，12000 r/min 離心20 min（離心半徑10 cm），取上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度，100 ℃加熱使蛋白變性， 定量后， 進行SDSPAGE 電泳， 電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，加入適量封閉液封閉2 h，TBST 洗膜，將膜放入1∶1000 稀釋的mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K一抗中4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜， 放入1∶4000 稀釋的HRP 標記的二抗中室溫孵育2 h，TBST 洗膜，加入ECL 化學(xué)發(fā)光劑，曝光顯影，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對表達水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況觀察 荷瘤小鼠在注射U14 細胞后4 d 腋下出現(xiàn)腫瘤，小鼠弓背、脫毛，精神萎頓，行動遲緩，活動減少，反應(yīng)遲鈍，其中半枝蓮組小鼠上述狀態(tài)程度最輕。

2.2 各組小鼠腫瘤生長曲線 模型組腫瘤體積隨時間延長之間逐漸增加；LPA 組較模型組腫瘤生長更快；半枝蓮組腫瘤生長明顯減慢；半枝蓮+LPA組腫瘤生長較模型組慢，但較半枝蓮組快。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤生長曲線

2.3 各組小鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率 瘤質(zhì)量和抑瘤率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 與模型組比較，LPA 組瘤質(zhì)量增加， 半枝蓮組、 半枝蓮+LPA 組瘤質(zhì)量減?。≒＜0.05）；與LPA 組比較，半枝蓮組、半枝蓮+LPA 組瘤質(zhì)量減小，抑瘤率升高（P＜0.05）；與半枝蓮組比較，半枝蓮+LPA 組瘤質(zhì)量增加，抑瘤率降低（P＜0.05）。 見表1。

表1 各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率（±s，n=15）

表1 各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率（±s，n=15）

注：與模型組比較，aP<0.05；與LPA 組比較，bP<0.05；與半枝蓮組比較，cP<0.05。

組別 瘤質(zhì)量（g）模型組LPA 組半枝蓮組半枝蓮+LPA 組F 值P 值2.53±0.15 2.92±0.17a 1.27±0.13ab 1.86±0.14abc 363.072＜0.001抑瘤率（%）—-15.41±1.87 49.80±2.01b 26.48±1.98abc 428.236＜0.001

2.4 各組小鼠腫瘤組織細胞周期和細胞凋亡率G0/G1 期、S 期細胞及凋亡率組間比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 與模型組比較，LPA 組G0/G1期細胞減少，S 期細胞增加，凋亡率降低，半枝蓮組和半枝蓮+LPA 組G0/G1 期細胞增加，S 期細胞減少，凋亡率升高（P＜0.05）；與半枝蓮組比較，半枝蓮+LPA 組G0/G1 期細胞減少，S 期細胞增加，凋亡率降低（P＜0.05）。 各組G2/M 期細胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織細胞周期和細胞凋亡率（±s，n=15）

表2 各組小鼠腫瘤組織細胞周期和細胞凋亡率（±s，n=15）

注：與模型組比較，aP<0.05；與LPA 組比較，bP<0.05；與半枝蓮組比較，cP<0.05。

組別 G0/G1（%）模型組LPA 組半枝蓮組半枝蓮+LPA 組F 值P 值35.59±3.26 22.38±2.67a 65.97±4.15ab 43.16±3.57abc 139.935＜0.001 S（%） G2/M（%）43.83±3.75 54.08±3.34a 12.83±2.11ab 32.72±2.93abc 163.068＜0.001 20.58±2.61 23.44±3.85 21.38±2.86 24.12±2.72 1.503 0.252凋亡率（%）8.21±3.05 3.16±1.78a 45.69±3.57ab 24.85±3.32abc 203.317＜0.001

2.5 各組小鼠腫瘤組織學(xué)觀察結(jié)果 HE 染色顯示，模型組腫瘤組織細胞數(shù)量豐富，排列密集，核大深染，核異型，核漿比例高，無明顯萎縮壞死現(xiàn)象；LPA 組與模型組形態(tài)相似， 腫瘤細胞生長良好；半枝蓮組可見凋亡細胞，數(shù)量明顯減少，核碎裂，出現(xiàn)萎縮、壞死現(xiàn)象；半枝蓮+LPA 組較模型組細胞數(shù)量減少，但較半枝蓮組多，可見少量萎縮壞死細胞。 見圖2。

圖2 腫瘤組織HE 染色結(jié)果（×400，A：模型組；B：LPA 組；C：半枝蓮組；D：半枝蓮+LPA 組）

2.6 各組小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax 蛋白表達水平腫瘤組織Bcl-2、Bax 陽性表達率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 與模型組比較，LPA 組Bcl-2 陽性表達率升高，Bax 陽性表達率降低， 半枝蓮組、半枝蓮+LPA 組Bcl-2 陽性表達率降低，Bax 陽性表達率升高（P＜0.05）；與半枝蓮組比較，半枝蓮+LPA 組Bcl-2 陽性表達率升高，Bax 陽性表達率降低（P＜0.05）。 見圖3。

圖3 腫瘤組織Bcl-2、Bax 蛋白表達免疫組化結(jié)果（×400，A：模型組；B：LPA 組；C：半枝蓮組；D：半枝蓮+LPA 組）

2.7 各組小鼠腫瘤組織mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表達水平 腫瘤組織p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表達組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，LPA 組p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表達增加，半枝蓮組和半枝蓮+LPA 組p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表達減少（P＜0.05）；與半枝蓮組比較， 半枝蓮組+LPA 組p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表達增加（P＜0.05）。 各組mTOR、P70S6K 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表3、圖4。

表3 各組小鼠腫瘤組織mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表達（±s，n=5）

表3 各組小鼠腫瘤組織mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表達（±s，n=5）

注：與模型組比較，aP<0.05；與LPA 組比較，bP<0.05；與半枝蓮組比較，cP<0.05。

組別 mTOR模型組LPA 組半枝蓮組半枝蓮+LPA 組F 值P 值1.13±0.12 1.15±0.11 1.11±0.13 1.12±0.11 0.105 0.956 p-mTOR P70S6K 0.84±0.08 0.98±0.09a 0.48±0.06ab 0.71±0.07abc 39.268＜0.001 0.95±0.11 0.93±0.12 0.92±0.11 0.97±0.10 0.202 0.893 p-P70S6K 0.72±0.08 0.89±0.09a 0.37±0.05ab 0.59±0.06abc 48.414＜0.001

圖4 腫瘤組織mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表達（A：模型組；B：LPA 組；C：半枝蓮組；D：半枝蓮+LPA 組）

3 討論

動物性移植腫瘤模型的建立對于研究腫瘤治療具有重要意義， 其作為體內(nèi)抗腫瘤藥物篩選的有效方式，具有接種成功率高、個體差異小、實驗周期短等優(yōu)點，易于客觀判斷藥物療效[6]。 本研究采用皮下移植瘤模型，均接種成功，接種后第4 天可見小鼠左前腋下接種部位隆起，隨時間延長，包塊逐漸增大，腫瘤無自行消退，而使用半枝蓮干預(yù)的小鼠，腫瘤生長趨勢明顯低于模型組，提示宮頸癌荷瘤小鼠模型建立成功。

腫瘤細胞具有無限增殖能力， 通過影響或調(diào)節(jié)細胞周期，可抑制腫瘤生長，發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。細胞凋亡對維持機體自身穩(wěn)定至關(guān)重要，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮負調(diào)控作用， 通過誘導(dǎo)細胞凋亡，阻滯腫瘤生長，是抗腫瘤的有效途徑之一[8-9]。 化學(xué)藥物在殺死腫瘤細胞的同時， 可導(dǎo)致機體免疫力下降，植物中的多糖成分副作用相對較小，臨床已被成功用于抗腫瘤治療[10-11]。 研究顯示，多糖可通過阻滯細胞周期及誘導(dǎo)凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[12-13]。Li 等[14]報道，半枝蓮多糖對肝癌荷瘤小鼠具有明顯抑瘤作用。Jin 等[15]研究表明，半枝蓮可抑制結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗癌作用。另有研究顯示， 半枝蓮和白花蛇舌草配伍可降低腫瘤細胞糖酵解水平， 抑制胰腺荷瘤小鼠腫瘤生長[16]。 本研究半枝蓮組小鼠腫瘤體積較模型組減小，抑瘤率達49.80%，G0/G1 期細胞顯著增多，S 期細胞顯著減少，凋亡率升高，且病理組織學(xué)檢查顯示腫瘤細胞數(shù)量減少，發(fā)生萎縮和壞死，提示半枝蓮多糖將腫瘤細胞阻滯在G0/G1 期， 延長細胞周期，減少參與分裂細胞數(shù)，促進凋亡，發(fā)揮抑瘤作用。

mTOR 參與細胞增殖、 代謝和分化等過程中，通過磷酸化活化下游的P70S6K 發(fā)揮生物學(xué)作用[17]。 mTOR/P70S6K 信號通路與癌細胞生長、增殖密切相關(guān)，卵巢癌、食管癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均存在mTOR/P70S6K 信號通路調(diào)節(jié)異常[18-19]。Bcl-2 表達水平與惡性腫瘤發(fā)展關(guān)系密切，Bcl-2 可抑制細胞凋亡，Bax 為Bcl-2 同源基因，對細胞具有促凋亡作用。 mTOR/P70S6K 信號通路活化可增加Bcl-2 表達， 減少細胞凋亡， 抑制TOR/P70S6K 信號通路，可作為抗腫瘤靶點。 LPA 參與細胞多種生理病理過程，可通過競爭性結(jié)合，激活mTOR[20]。 本研究采用LPA 干預(yù)后，p-mTOR 和p-P70S6K 蛋白表達明顯增加，Bcl-2 表達較高，Bax表達較低，病理學(xué)顯示癌細胞生長良好，提示TOR/P70S6K 信號通路被激活，促進腫瘤細胞增殖；而使用半枝蓮多糖治療后， 各項指標與LPA 呈相反趨勢； 在使用半枝蓮多糖治療后同時使用LPA，pmTOR 和p-P70S6K 表 達 升 高，Bcl-2 表 達 升 高，Bax 表達降低， 半枝蓮多糖的抑瘤作用明顯下降，提示半枝蓮多糖可能通過抑制TOR/P70S6K 信號通路，阻滯細胞停留在G1/G0 期，調(diào)控凋亡基因表達，促進細胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用。

綜上所述， 半枝蓮多糖對宮頸癌荷瘤小鼠具有明顯抑制腫瘤生長作用， 可能與抑制TOR/P70S6K 信號通路調(diào)節(jié)細胞周期，促進細胞凋亡有關(guān)，為臨床治療宮頸癌提供實驗依據(jù)。