糞便沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌分離培養(yǎng)方法研究

劉玉玲，黃煥宜，肖樹(shù)榮，何國(guó)華，謝淑賢，黎青梅

陽(yáng)江市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 陽(yáng)江 529500

食源性疾病是具有感染性質(zhì)或中毒性質(zhì)的一類疾病，是全球范圍內(nèi)分布最廣泛、最常見(jiàn)的疾病之一，也是全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。其中分別由沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌引起的非傷寒沙門菌病、志賀菌病和副溶血性弧菌病都屬于我國(guó)細(xì)菌性食源性疾病監(jiān)測(cè)名錄中的病種。對(duì)于沙門菌、志賀菌和副溶血性弧菌的檢查，雖然免疫學(xué)和分子生物學(xué)等快速檢測(cè)技術(shù)逐漸受到青睞，但仍存在成本較高以及無(wú)法區(qū)分細(xì)菌活性等缺點(diǎn)[3-5]。目前廣大基層醫(yī)院以及哨點(diǎn)醫(yī)院仍然以金標(biāo)準(zhǔn)即傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法為主，故提高糞便培養(yǎng)的檢出率尤為重要。但糞便采樣后的放置溫度、放置時(shí)間以及使用增菌肉湯時(shí)的增菌時(shí)間關(guān)系到檢驗(yàn)分析前和分析中的質(zhì)量控制，與檢出率密切相關(guān)。本文就糞便懸液放置溫度、放置時(shí)間以及增菌肉湯增菌時(shí)間對(duì)沙門菌、志賀菌和副溶血性弧菌檢出率的影響進(jìn)行研究，以期優(yōu)化糞便的分離培養(yǎng)方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 菌株 沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌各20株。其中標(biāo)準(zhǔn)菌株或室間質(zhì)評(píng)菌株16株，來(lái)源于國(guó)家或廣東省衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心，包括腸炎沙門菌ATCC13076等6株沙門菌、福氏志賀菌ATCC51572等7株志賀菌、副溶血弧菌ATCC17802等3株副溶血弧菌。臨床菌株44株，均經(jīng)廣東省疾控中心核準(zhǔn)。包括沙門菌SE001等14株、志賀菌SH001等13株、副溶血弧菌VP001等17株。

1.2 試劑 沙門志賀肉湯、堿性蛋白胨水均購(gòu)自廣州市迪景微生物科技有限公司。沙門菌顯色平板、弧菌顯色平板購(gòu)自鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司。麥康凱瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌菌株各設(shè)置以下三組實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 放置溫度實(shí)驗(yàn) 用滅菌生理鹽水配置濃度約106cfu/mL[6-7]的菌懸液，再制備糞便懸液。吸取200μL菌懸液和0.5 g健康人的新鮮混合糞便混勻(不含目標(biāo)病原菌)，再將糞便懸液平均分為兩管，分別放置4℃2 h和25℃2 h，2 h時(shí)各接種一環(huán)(10μL)糞便懸液至相應(yīng)選擇性平板。含沙門菌糞便懸液接種沙門菌顯色平板，含志賀菌糞便懸液接種麥康凱瓊脂平板[8]，含副溶血弧菌糞便懸液接種弧菌顯色平板。上述平板經(jīng)35℃培養(yǎng)至18～24 h，挑取可疑菌落經(jīng)生化及血清學(xué)鑒定。統(tǒng)計(jì)陰陽(yáng)性樣本數(shù)，計(jì)算檢出率(檢出率=陽(yáng)性樣本數(shù)/樣本總數(shù)×100%)。

1.3.2 放置時(shí)間實(shí)驗(yàn) 按上述方法制備106cfu/mL的糞便懸液后，分別于常溫放置0 h、2 h、3 h和6 h時(shí)接種相應(yīng)平板，培養(yǎng)后挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，計(jì)算檢出率。

1.3.3 肉湯增菌時(shí)間實(shí)驗(yàn) 制備濃度約106cfu/mL的菌懸液后，吸取100μL加入到相應(yīng)增菌肉湯(8 mL)中，再加入0.5 g的健康人糞便，混勻后放置35℃增菌培養(yǎng)。其中沙門菌、志賀菌用沙門志賀肉湯，副溶血弧菌用堿性蛋白胨水。并于增菌0 h、8 h、12 h和24 h時(shí)，各接種一環(huán)增菌肉湯至相應(yīng)平板。培養(yǎng)后挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，計(jì)算檢出率，并記錄陽(yáng)性樣本菌落形態(tài)特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Excel2007和SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同放置溫度糞便懸液的檢出率比較 糞便懸液放置4℃2 h或25℃2 h，沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌的檢出率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同放置溫度糞便懸液的檢出率比較(株)

2.2 不同放置時(shí)間糞便懸液的檢出率變化趨勢(shì) 糞便懸液常溫放置0 h、2 h、3 h或6 h，沙門菌和副溶血弧菌的檢出率均在85%以上，但志賀菌檢出率隨放置時(shí)間增加，檢出率由75%(0 h)下降至5%(6 h)，見(jiàn)圖1。

圖1 糞便懸液常溫放置0 h、2 h、3 h和6 h，沙門菌、志賀菌和副溶血孤菌檢出率的變化趨勢(shì)

2.3 不同肉湯增菌時(shí)間糞便懸液的檢出率及陽(yáng)性樣本菌落特征 沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌增菌前(0 h)檢出率均為0，增菌后檢出率均有升高。增菌8 h、12 h和24 h，沙門菌的檢出率分別為90%、90%和95%，志賀菌的檢出率分別為50%、20%和5%。副溶血弧菌的檢出率均為95%。分別含三種病原菌的糞便樣本在相應(yīng)平板上有獨(dú)特的菌落特征，見(jiàn)表2。

表2 糞便懸液經(jīng)肉湯增菌不同時(shí)間的沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌檢出率及陽(yáng)性樣本菌落特征

3 討論

在常規(guī)分離平板可檢出的靈敏度濃度為106cfu/mL前提下[6-7]，放置溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)4℃冷藏或25℃常溫兩種溫度環(huán)境均放置2 h，對(duì)其活性的影響相當(dāng)[8]。分析其原因可能與沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)有關(guān)，因?yàn)樯抽T菌在水中可生存15 d，在-25℃環(huán)境下也可存活10個(gè)月以上[9]。志賀菌在冰塊中可生存3個(gè)月[10]，在牛奶、果蔬中可生存1～2周。副溶血弧菌能在抹布和砧板上生存1個(gè)月以上，在海水中可存活47 d[11]。放置時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門菌和副溶血弧菌的糞便標(biāo)本6 h內(nèi)接種，檢出率可達(dá)85%以上。但是志賀菌檢出率呈明顯的下降趨勢(shì)，放置6 h可由75%下降至5%，其原因可能是志賀菌的抵抗力較沙門菌和副溶血弧菌弱，容易被腸道正常菌群的代謝物抑制[12]，故其在糞便中的生存時(shí)間較為短暫。馬新建等[13]也認(rèn)為如果送檢不及時(shí)志賀菌可能已死亡，因而難以培養(yǎng)出菌落，尚紅等[14]也提出需培養(yǎng)志賀菌應(yīng)采樣后30 min內(nèi)送檢。

肉湯增菌時(shí)間實(shí)驗(yàn)表明糞便經(jīng)增菌肉湯增菌至適宜時(shí)間接種選擇性顯色平板是提高沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌檢出率的有效手段。使用沙門志賀肉湯增菌后接種沙門菌顯色平板，篩查沙門菌效果顯著，篩查志賀氏菌有效果。因?yàn)樯抽T志賀肉湯中的亞硒酸氫鈉可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和部分陰性桿菌，讓沙門菌和志賀菌繁殖生長(zhǎng)起來(lái)。但其對(duì)沙門菌和志賀菌的適宜增菌時(shí)間有所不同，根據(jù)研究結(jié)果沙門菌的適宜增菌時(shí)間為8～24 h，而志賀菌的最佳增菌時(shí)間為8 h。因?yàn)樵鼍? h后，志賀菌會(huì)被抑制或增菌效果不及雜菌，甚至出現(xiàn)個(gè)別雜菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)而導(dǎo)致其檢出率下降，這說(shuō)明使用增菌肉湯時(shí)要把握好增菌時(shí)間。使用堿性蛋白胨水增菌8～24 h接種弧菌顯色平板，篩查副溶血弧菌效果俱佳，是因?yàn)閴A性蛋白胨水的高pH值環(huán)境特點(diǎn)，使大腸菌群和其他雜菌被部分或明顯抑制，而嗜鹽性的副溶血弧菌生長(zhǎng)良好，增菌6～9 h即可形成菌膜，再加上弧菌顯色平板能明顯抑制非弧菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，使雜菌生長(zhǎng)為明顯異于副溶血弧菌的細(xì)小菌落，從而達(dá)到很好的分離效果。研究還發(fā)現(xiàn)，使用增菌肉湯增菌0 h(未增菌)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)推算，三種病原菌的理論濃度為1.23×104cfu/mL，但其檢出率均為0，可能是因?yàn)槿祟惸c道菌群重量可達(dá)2 kg，共生著1013～1014個(gè)細(xì)菌，包含500～1 000種不同類型[15]，所以實(shí)驗(yàn)中加入的病原菌菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于糞便中正常腸道菌群數(shù)量，致使其無(wú)法通過(guò)平板分離出來(lái)。

同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，志賀菌三組實(shí)驗(yàn)的檢出率均較低，這與多地報(bào)道的志賀菌的檢出率較低相符[16-17]。除了志賀菌在糞便中抵抗力相對(duì)較低的原因外，還可能與麥康凱瓊脂平板篩查志賀菌效果不佳有關(guān)。相對(duì)而言，實(shí)驗(yàn)中用于篩查沙門菌的沙門菌顯色平板和篩查副溶血弧菌的弧菌顯色平板均屬于高選擇性平板，能使目標(biāo)菌呈現(xiàn)明顯區(qū)別于其他腸道正常菌群的菌落特征，體現(xiàn)在顯色、菌落大小以及抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的能力方面。但麥康凱瓊脂平板為中等或弱選擇性培養(yǎng)基，臨床實(shí)驗(yàn)室用于篩查志賀菌，是因?yàn)橹举R菌不發(fā)酵乳糖，在此培養(yǎng)基上為無(wú)色中等或小菌落。然而從顏色形態(tài)等視覺(jué)效果上志賀菌并不具有優(yōu)勢(shì)，在以下兩種情況會(huì)出現(xiàn)假陰性：①糞便中志賀菌菌量較低或者分區(qū)劃線的單個(gè)菌落較少時(shí)會(huì)被其他發(fā)酵乳糖的腸道桿菌粉紅色菌落覆蓋或與之融合。②宋內(nèi)氏志賀菌在麥康凱瓊脂平板上存在光滑型和粗糙型兩種菌落[8，14]，因部分菌株可遲緩發(fā)酵乳糖從而在麥康凱瓊脂平板上呈現(xiàn)淺粉色，而非常見(jiàn)的無(wú)色透明圓形菌落。因此可認(rèn)為，單獨(dú)使用麥康凱瓊脂平板篩查志賀菌效果不佳，應(yīng)改用或聯(lián)合使用其他選擇性平板，如木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)、瓊脂(HE)平板等[12]。此外，臨床微生物人員應(yīng)具備分區(qū)劃線獲得較多單個(gè)菌落的能力和過(guò)硬的病原菌形態(tài)甄別能力。

綜上所述，可經(jīng)以下途徑優(yōu)化糞便的分離培養(yǎng)方法，提高沙門菌、志賀菌和副溶血弧菌檢出率：①糞便經(jīng)專用增菌肉湯增菌至適宜時(shí)間接種選擇性顯色平板。篩查沙門菌可使用沙門志賀肉湯增菌8～24 h接種沙門顯色平板。篩查副溶血弧菌可使用堿性蛋白胨水增菌8～24 h接種弧菌顯色平板。②糞便采樣后及時(shí)接種，否則4℃或25℃放置。如未經(jīng)增菌，6 h內(nèi)直接接種選擇性平板，適用于沙門菌和副溶血弧菌菌量大于106cfu/mL的糞便樣本。③單獨(dú)使用麥康凱瓊脂平板篩查志賀菌效果不佳，可用沙門志賀肉湯增菌8 h改用或聯(lián)合接種其他選擇性平板。