腎著湯對(duì)寒濕性腰腿痛小鼠模型的治療作用機(jī)制研究

孫秀玲，張靖涵

（1.山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)學(xué)系，山東煙臺(tái) 264199；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)校區(qū)特殊教育學(xué)院，山東煙臺(tái) 264033）

腰腿痛是臨床常見(jiàn)腰腿部退行性疾病，以腰部疼痛并放射至下肢引起局部麻木疼痛為主要表現(xiàn)。近年來(lái)，隨著老齡化進(jìn)程加快，腰腿痛發(fā)病率逐年上升[1]。腰腿痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與腰椎間盤(pán)突出、腰椎管狹窄、腰肌勞損等密切相關(guān)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腰腿痛治療包括內(nèi)治和外治方法，但內(nèi)科中成藥藥物治療療效差異顯著，外科手術(shù)治療存在一定風(fēng)險(xiǎn)，且具有較嚴(yán)格的適應(yīng)證和禁忌證，限制了臨床應(yīng)用[2-3]。中醫(yī)學(xué)具有療效肯定、安全性高特點(diǎn)。近年來(lái)，隨著國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展的重視，中醫(yī)藥在腰腿痛治療中的作用備受臨床關(guān)注[4]。寒濕性腰腿痛是臨床常見(jiàn)證型，腎著湯即甘姜苓術(shù)湯，出自《金匱要略》，既往已有報(bào)道將其用于腰椎間突出癥患者，對(duì)改善腰腿痛起到顯著效果[5]。本研究通過(guò)建立動(dòng)物模型，進(jìn)一步觀察其在寒濕性腰腿痛中的臨床效果和作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為BALB/c清潔級(jí)健康小鼠[山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）20090001]，雌雄各半。小鼠周齡10～12周，體質(zhì)量16～20 g，平均體質(zhì)量（18.35±1.62）g。小鼠均在自然光周期條件下飼養(yǎng)，控制室溫在20～22 ℃，相對(duì)濕度65%～70%，顆粒飼料和墊料均由山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校實(shí)驗(yàn)中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只小鼠分為A組、B組和C組，每組10只。A組小鼠中雌性6只，雄性4只；周齡10～12周；體質(zhì)量16～19 g，平均體質(zhì)量（17.96±1.50）g。B組小鼠中雌性5只，雄性5只；周齡10～12周；體質(zhì)量16～20 g，平均體質(zhì)量（18.02±1.47）g。C組小鼠中雌性4只，雄性6只；周齡10～12周；體質(zhì)量17～20 g，平均體質(zhì)量（18.15±1.63）g。3組小鼠一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），組間具有可比性。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 ①A、B兩組小鼠建模。建模方法：將小鼠放入500 mL燒杯中，燒杯倒入250 mL水，水溫＜12 ℃，浸泡30～90 min。觀察到小鼠腰腿不利、難以正常行走、渾身戰(zhàn)栗提示寒濕性腰腿痛建模成功。②干預(yù)方法。A組小鼠給予腎著湯干預(yù)，組方：甘草6 g、白術(shù)6 g、干姜12 g、茯苓12 g。中藥購(gòu)自山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院中藥房，由中藥房煎制，每1 mL含生藥為0.18 g，制成真空包裝，低溫保存?zhèn)溆?。按生?.8 g/kg計(jì)算劑量，灌胃，早晚各1次，連續(xù)干預(yù)3周。B組和C組小鼠給予常規(guī)喂養(yǎng)。③檢測(cè)方法。在腎著湯干預(yù)3周后記錄3組小鼠扭體潛伏期和扭體次數(shù)。采集小鼠腹主動(dòng)脈血3 mL，采用臺(tái)式高速離心機(jī)[上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司，滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第1410290號(hào)，型號(hào)：GL-18B型]對(duì)血液標(biāo)本以3 000 r/min離心10 min，采用全自動(dòng)血流變測(cè)試儀[上海涵飛醫(yī)療器械有限公司，京藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第2400319號(hào)，型號(hào)：ZL6000型]檢測(cè)血漿黏度，計(jì)算紅細(xì)胞聚集率和紅細(xì)胞變形指數(shù)。然后將小鼠全部處死，取小鼠豎脊肌組織，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和免疫組化法檢測(cè)小鼠組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照以2-ΔΔCt法計(jì)算表示相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s、變性5 s，60 ℃退火40 s，循環(huán)40次。免疫組化（SP法染色）檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以著色為細(xì)胞結(jié)果陽(yáng)性，以著色面積表示陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)表2。以?xún)身?xiàng)評(píng)分之和≥3分為結(jié)果陽(yáng)性[6]。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3 觀察指標(biāo) ①比較3組小鼠干預(yù)后扭體潛伏期和扭體次數(shù)。②比較3組小鼠血漿黏度、血小板聚集率及紅細(xì)胞變形指數(shù)。③比較3組小鼠VEGF、PCNA及NGF相對(duì)表達(dá)量和陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x）表示，多組間比較行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠干預(yù)后扭體潛伏期和扭體次數(shù)比較 C組小鼠扭體潛伏期顯著長(zhǎng)于A組和B組，扭體次數(shù)顯著少于A、B兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；A組小鼠扭體潛伏期長(zhǎng)于B組，扭體次數(shù)少于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 3組小鼠干預(yù)后扭體潛伏期和扭體次數(shù)比較（x）

2.2 3組小鼠血液流變學(xué)水平比較 C組小鼠血小板聚集率和紅細(xì)胞變形指數(shù)均低于A、B兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；A組血漿黏度、血小板聚集率及紅細(xì)胞變形指數(shù)水平顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 3組小鼠血液流變學(xué)水平比較（x）

2.3 3組小鼠VEGF、PCNA及NGF表達(dá)水平比較 A組小鼠豎脊肌組織中NGF相對(duì)表達(dá)量和陽(yáng)性率均顯著低于B組，VEGF和PCNA相對(duì)表達(dá)量和陽(yáng)性率均高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 3組小鼠VEGF、PCNA及NGF表達(dá)水平比較

3 討論

腰腿痛屬中醫(yī)痹癥范疇，其病位在腎。《景岳全書(shū)》明確記載，腰痛證，遇陰雨或久坐痛而垂者，濕也；遇諸寒而痛及喜暖而惡寒者，寒也[7]。中醫(yī)藥在腰腿痛治療中歷史悠久，腰腿痛的治療當(dāng)以溫腎散寒、舒經(jīng)通絡(luò)為治法。腎著湯配方較為簡(jiǎn)便，以干姜配甘草，發(fā)揮溫中散寒功效，另以茯苓、白術(shù)健脾除濕。周佳明等[8]研究也證實(shí)，腎著湯具有祛寒除濕功能，不僅有助于減輕局部腰腿痛癥狀，還可改善腰背部肌群協(xié)調(diào)性，緩解腰肌勞損，在腰腿痛治療中具有重要價(jià)值。但目前臨床對(duì)腎著湯的療效機(jī)制尚不明確。本研究利用冷水浴方法建立寒濕性腰腿痛模型，并通過(guò)對(duì)比干預(yù)觀察腎著湯的治療效果，結(jié)果顯示，干預(yù)后A組小鼠扭體次數(shù)顯著少于B組，說(shuō)明腎著湯能顯著減輕局部疼痛，這與既往報(bào)道一致[9]。

NGF是機(jī)體重要的疼痛調(diào)控因子，在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，在腰椎間盤(pán)突出癥發(fā)生后，機(jī)械性壓迫作用和炎性反應(yīng)引起NGF表達(dá)增加[10]。VEGF是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，能增加血管通透性，促進(jìn)血管再生，在椎間盤(pán)突出癥病理進(jìn)程中對(duì)緩解和修復(fù)椎間盤(pán)病變具有重要作用[11]。另外，PCNA與軟骨細(xì)胞增殖水平具有顯著相關(guān)性，是評(píng)估細(xì)胞增殖和修復(fù)能力的重要指標(biāo)。隨著腰腿痛康復(fù)進(jìn)程加快，PCNA水平也隨之升高[12]。臨床也有研究顯示，PCNA與VEGF存在正相關(guān)[13]，支持本研究結(jié)果。臨床還有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，正常組、造模組及干預(yù)組小鼠PCNA水平差異較大[14]。本研究顯示，A組小鼠豎脊肌組織中NGF相對(duì)表達(dá)量和陽(yáng)性率均低于B組，而VEGF和PCNA顯著高于B組，提示腎著湯可能通過(guò)調(diào)控VEGF、PCNA及NGF，延緩腰椎間盤(pán)突出等病理進(jìn)程，發(fā)揮治療作用。這一結(jié)果說(shuō)明腎著湯可能通過(guò)調(diào)控機(jī)體神經(jīng)血管因子，改善局部癥狀，達(dá)到治療目的。另外，中醫(yī)認(rèn)為，寒凝血瘀也是引起腰腿痛的重要機(jī)制[15-16]。本研究還顯示，A組小鼠血漿黏度、血小板聚集率及紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著低于B組，提示腎著湯有助于改善寒濕性腰腿痛小鼠局部血流，這與腎著湯祛寒濕、健脾胃作用密切相關(guān)[17-18]，這也說(shuō)明腎著湯可能通過(guò)改善局部微血流，糾正局部血液高凝狀態(tài)，從而提高腰腿痛治療效果，這對(duì)于臨床早期干預(yù)具有重要實(shí)用價(jià)值[19]。

綜上，腎著湯治療寒濕性腰腿痛效果顯著，有助于改善局部微血流，與其調(diào)節(jié)NGF、VEGF及PCNA等細(xì)胞因子水平有關(guān)。