硫自養(yǎng)反硝化顆粒表面與間隙微生物群落特征和基因分布

呂小梅,吳毅聰,陳桂連,徐劍暉,劉 鵬,胡俊杰

硫自養(yǎng)反硝化顆粒表面與間隙微生物群落特征和基因分布

呂小梅,吳毅聰,陳桂連,徐劍暉,劉 鵬,胡俊杰*

(東莞理工學(xué)院,廣東 東莞 523808)

研究了單質(zhì)硫顆粒自養(yǎng)反硝化柱中表面和間隙生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)、功能基因和代謝途徑等生物信息學(xué)特征.結(jié)果表明，硫顆粒表面生物膜的微生物菌群多樣性低于間隙生物膜.氮代謝功能基因豐度差異較為顯著,間隙生物膜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的胞外轉(zhuǎn)運蛋白基因豐度遠(yuǎn)高于表面生物膜,分別為0.0792%、0.109%與0.0157%、0.0314%.對于還原性反硝化代謝,表面生物膜的總基因豐度卻明顯低于間隙生物膜,分別為0.367%、0.406%.此外,參與反硝化過程的基因豐度明顯不同,特別是將NO3-還原成NO2-以及將N2O還原成N2過程中的基因.對于硫代謝,沒有觀察到明顯的差異.APS(硫酸腺苷)氧化是將SO32-氧化為SO42-的主要途徑,其基因豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接氧化途徑,分別為0.137%與0.0005%(表面)、0.138%與0.0007% (間隙).結(jié)果表明,在單質(zhì)硫自養(yǎng)反硝化過程中,間隙生物膜與表面生物膜中的微生物存在合作關(guān)系,協(xié)同促進(jìn)硫自養(yǎng)反硝化脫氮過程.

硫自養(yǎng)反硝化；生物膜；菌群結(jié)構(gòu)；功能基因

作為氮循環(huán)過程之一,硝酸鹽是地下水和地表水中普遍存在的污染物,對公眾健康存在潛在的風(fēng)險[1].生物反硝化脫氮是目前最主流的脫氮技術(shù).傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化因高效性而得到廣泛應(yīng)用,然而,該過程需要有機(jī)物作為電子供體,對于缺乏有機(jī)物的水體需要額外補(bǔ)充碳源以實現(xiàn)有效脫氮,這將導(dǎo)致處理成本的增加和二次污染的風(fēng)險.

與異養(yǎng)反硝化相比,硫自養(yǎng)反硝化是以硫化合物(S2-,S2O32-,S4O62-,SO32-)和單質(zhì)硫(S0)為電子供體實現(xiàn)反硝化脫氮[2].硫自養(yǎng)反硝化過程以無機(jī)碳為碳源,可避免有機(jī)碳源的投加.硫自養(yǎng)反硝化污泥產(chǎn)率低于異養(yǎng)反硝化,可減少后續(xù)污泥處理.此外,硫自養(yǎng)反硝化的運行與管理成本也相對較低.由于其優(yōu)勢,逐漸成為可替代異養(yǎng)反硝化的脫氮技術(shù)[3-4],已用于飲用水[5-6]、地下水[7-8]、廢水和垃圾填埋場滲濾液[9-11]中的硝酸鹽的去除.研究表明,單質(zhì)硫可以達(dá)到與其他還原性硫化物類似的自養(yǎng)反硝化脫氮效果[12],且單質(zhì)硫不溶于水,無毒害作用,價格低廉,作為自養(yǎng)反硝化硫源處理安全要求較高的飲用水與地下水更受青睞.

單質(zhì)硫自養(yǎng)反硝化通常采用填充床反應(yīng)器,將顆粒硫裝入柱中.接種和運行后,微生物將逐漸在硫顆粒表面富集形成生物膜.研究微生物種類及其在生物膜中的分布,有助于從微觀角度解釋不同菌種之間的合作機(jī)制,指導(dǎo)反應(yīng)系統(tǒng)宏觀條件的控制[13].通過對生物濾池中硝化細(xì)菌的活性和分布研究,發(fā)現(xiàn)氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌在生物膜中位置相近,因此,氨氧化和亞硝酸鹽氧化反應(yīng)可以依次快速進(jìn)行[14].基于高通量測序技術(shù),Sun等[15]揭示了耦合甲烷氧化的反硝化脫氮MBR生物膜內(nèi)側(cè)與外側(cè)微生物菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異.

對于單質(zhì)硫自養(yǎng)反硝化,目前大多數(shù)研究主要關(guān)注生物膜內(nèi)微生物菌群組成與空間分布.硫自養(yǎng)填充床反應(yīng)器降解水中高濃度高氯酸鹽時,反應(yīng)器內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)隨高度的變化而變化,硫氧化菌隨反應(yīng)器高度的增加而減少,由底部57.78%減少到上部的32.19%,同時硫化氫氧化菌隨反應(yīng)器高度的增加而增加,由底部4.35%增加到上部的22.24%[16].此外,研究表明水力停留時間(HRT)會改變反應(yīng)器內(nèi)部微生物群落多樣性,微生物群落結(jié)構(gòu)分布情況與反應(yīng)器高度有關(guān)[17].然而,硫顆粒自養(yǎng)反硝化運行過程中,除了填料上富集有致密的生物膜,硫顆粒間隙中也存在大量的生物膜.表面與間隙生物膜之間存在怎樣的菌群差異,二者在代謝過程中是否存在一定的協(xié)同作用.針對此問題,基于連續(xù)運行的顆粒硫自養(yǎng)反硝化填充柱,本研究采用16S rRNA測序和宏基因組測序,分析硫顆粒表面與間隙中微生物菌群結(jié)構(gòu)與代謝基因的差異,分析基于單質(zhì)硫自養(yǎng)反硝化的基質(zhì)代謝利用途徑.

1 材料和方法

1.1 實驗儀器和方法

柱形硫顆粒硫自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器內(nèi)徑為10cm、總高度為40cm,硫磺顆粒(直徑為3～5mm)填充高度為20cm,有效容積為1.57L.反應(yīng)器空床停留時間(EBRT)為1.5h,進(jìn)水采用自來水配置,其水質(zhì)特征見表1所示.此外,1L合成廢水中補(bǔ)充了0.3mL微量元素溶液.對進(jìn)水和出水中的硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測,以監(jiān)測反硝化性能.

1.2 化學(xué)分析

NH4+-N濃度采用納氏試劑分光光度法、NO3--N濃度采用紫外分光光度法、NO2--N濃度采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法.

表1 進(jìn)水水質(zhì)

1.3 生物膜樣本采集與分析

階段II運行穩(wěn)定后,排出硫柱中的水,將硫柱中的硫顆粒小心取出置于500mL燒杯中,用純凈水輕輕地洗三次,每次都收集清洗水中的生物膜.用鑷子將硫顆粒放入另一個燒杯中,燒杯底部殘余的生物膜與收集的上清液中生物膜混合,作為硫顆粒間隙生物膜.將裝有硫顆粒的燒杯中加入少量純凈水,超聲波清洗震蕩儀中超聲10min左右,收集脫落的生物膜,作為硫顆粒表面生物膜樣品.分別取適量的間隙生物膜與表面生物膜進(jìn)行后續(xù)微生物分析實驗研究[15].掃描電鏡樣品處理方法參考文獻(xiàn)[18].

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

采用PowerSoil?DNA Isolation Kit(Mobio,美國)提取生物膜樣品的總DNA.針對16S rRNA的V4高變異區(qū),采用Takara Ex Taq?DNA聚合酶試劑盒、i-Cycler(BioRad,Hercules,CA,USA)、以及引物對(515F與806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證,并使用微量紫外分光光度計(NanoDrop-1000)進(jìn)行定量分析.將兩個樣本的擴(kuò)增子混合,并保證最終混合物的質(zhì)量濃度相等,通過Illumina-Miseq測序儀進(jìn)行建庫和測序,測序策略為成對端測序(2×250bp).

對于宏基因組測序,首先將DNA打斷成300bp左右的片段.然后通過瓊脂糖凝膠電泳純化和回收目的片段,進(jìn)一步構(gòu)建基因文庫,Illumina-Miseq測序儀上以配對末端測序(2×250bp)的策略進(jìn)行測序(廣州美格生物科技有限公司).

2 結(jié)果和討論

2.1 反硝化脫氮效果

碳酸氫鈉為堿度來源,水力停留時間為1.5h條件下,單質(zhì)硫自養(yǎng)反硝化濾柱脫氮效果如圖1所示.第一階段進(jìn)水硝酸鹽氮濃度為26.30～31.59mg/L(平均為29.48mg/L).出水硝酸鹽氮濃度從18.0mg/L逐漸下降,并穩(wěn)定在1.38～1.98mg/L(平均為1.67mg/L),平均去除率為94.40%.出水亞硝酸鹽氮濃度為0～ 0.26mg/L.第二階段提高進(jìn)水硝酸鹽氮濃度值至45.53～53.44mg/L(平均為50.71mg/L),出水硝酸鹽氮濃度為4.00～6.89mg/L(平均為5.24mg/L),平均去除率為89.67%.出水亞硝酸鹽濃度為0.29～1.34mg/L,略高于第一階段.

圖1 硫顆粒自養(yǎng)反硝化脫氮效果

隨著進(jìn)水硝酸鹽負(fù)荷的增加,出水硝酸鹽濃度有所增加,去除率有所下降,但去除速率顯著提升,分別為18.34mg/(L×h)、30.31mg/(L×h),顆粒硫自養(yǎng)反硝化速率明顯高于活性污泥法硫自養(yǎng)反硝化[19].

2.2 微生物菌群特征

2.2.1 菌群多樣性 基于16S rRNA的細(xì)菌多樣性結(jié)果如表2所示.不同的多樣性指數(shù),包括:分類操作單元(operational taxonomic unit, OTU)數(shù)、Chao 1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)均表明,間隙生物中的細(xì)菌多樣性比表面生物更豐富.維恩圖分析結(jié)果顯示表面生物和間隙生物共享大多數(shù)的OTU(759),但獨有的OTU數(shù)量分別為138和398,亦表明間隙生物膜中的微生物多樣性更加豐富.

表2 表面與間隙生物膜的菌群多樣性

2.2.2 主導(dǎo)微生物分布 如圖2所示,硫顆粒表面與間隙生物在門級別以及變形菌門中綱的豐度分布情況并無顯著差異.

圖2 兩個樣品中不同門以及變形菌門中綱的豐度

Proteobacteria是豐度最高的門,在表面與間隙生物中豐度分別為89.0%、86.4%,其次是Bacteroidetes (3.52%、4.95%)、Chloroflexi(1.93%、1.76%)、Firmicutes (0.877%、0.963%),以上主導(dǎo)門經(jīng)常被報道于反硝化甚至自養(yǎng)反硝化污泥體系中[20-21].對于最高豐度的Proteobacteria,其下屬的β-proteobacteria豐度最高(57.9%、54.7%),其次分別為ε-proteobacteria(12.9%、13.0%)、γ-proteobacteria(11.5%、11.3%)、α-proteobacteria(3.92%、4.51%)、δ-proteobacteria(2.75%、2.79%).

在屬級別上,與硫自養(yǎng)微生物相關(guān)的菌屬的豐度如表3所示.是最豐富的屬,其次是和.上述屬在表面生物膜中的豐度略高于間隙生物膜,分別為28.76%、9.50%、1.25%和26.36%、9.22%、1.17%.此外,還檢測到與硫磺自養(yǎng)反硝化作用有關(guān)的屬[22],它們在表面和間隙生物膜中的豐度為0.0341%和0.0294%.表面生物膜中硫磺自養(yǎng)反硝化微生物的豐度總體上高于間隙生物膜,表明表面生物膜富集了更多的功能性微生物.此外,在生物膜中也檢測到了可能參與硫磺代謝和細(xì)菌間電子傳遞的屬[23-24],但在兩個生物膜樣品中豐度并無明顯差異.

掃描電鏡結(jié)果(圖3)也顯示生物膜中富集了豐富的硫氧化短桿菌和少量球菌,與文獻(xiàn)所述細(xì)菌形態(tài)一致.且表明硫表面分布了更多的硫自養(yǎng)反硝化微生物,分布也更密集,該結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致.

表3 不同生物膜樣品的硫自養(yǎng)反硝化微生物豐度

圖3 硫顆粒表面(a)與間隙(b)生物膜電鏡圖

2.3 功能基因與代謝途徑

基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫分析了硫顆粒表面與間隙微生物的基因注釋結(jié)果,重點比較了氮代謝與硫代謝的基因豐度.表面生物膜與間隙生物膜的硫代謝基因豐度基本接近,分別為0.415%、0.412%.表面生物膜的氮代謝基因豐度略高于間隙生物膜,分別為1.042%、1.008%.

2.3.1 氮代謝 污水處理廠(WWTPs)脫氮主要包括四個過程:氨化、硝化、反硝化和固氮.本研究主要關(guān)注硫自養(yǎng)反硝化過程,其代謝路徑以及參與各還原過程的酶編碼如圖4所示.

硫顆粒表面與間隙微生物中負(fù)責(zé)胞外硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白與亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的基因豐度如圖5所示.硫顆粒表面微生物和間隙微生物的胞外硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白豐度為0.0157%和0.0792%,細(xì)胞外亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白豐度為0.0314%和0.109%.這表明間隙微生物的胞外氮元素轉(zhuǎn)運蛋白基因豐度高很多.其原因可能是當(dāng)進(jìn)水流經(jīng)硫填充柱時,間隙微生物能夠接觸更高濃度的硝酸鹽,因為硝酸鹽需要從外部擴(kuò)散到表面生物膜的內(nèi)部并得以利用[25].因此,較高的硝酸鹽濃度激活了轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控與表達(dá).

圖4 硝酸鹽反硝化脫氮代謝路徑

圖5 胞外轉(zhuǎn)硝酸鹽與亞硝酸鹽運蛋白豐度

硝酸鹽的還原代謝包括異化還原、同化還原以及反硝化.硫顆粒表面生物膜與間隙生物膜中的三種硝酸鹽還原代謝基因豐度情況如圖6所示.

圖6 反硝化還原酶基因豐度

由圖6可以看出,對于參與異化還原與同化還原基因,表面生物膜中豐度分別為0.338%、0.318%;間隙生物膜中豐度分別為0.064%、0.057%.可見,表面生物膜中異化還原與同化還原基因豐度顯著高于間隙生物膜,且異化還原作用明顯高于同化還原作用.而對于反硝化脫氮代謝,表面基因豐度明顯低于間隙生物膜,分別為0.367%、0.406%.該結(jié)果可能同樣與間隙微生物接觸更多的硝酸鹽/亞硝酸鹽有關(guān).另外,間隙微生物中較高的轉(zhuǎn)運蛋白基因豐度也可能是間隙微生物較高的反硝化代謝基因豐度較高的原因之一.

硫顆粒表面與間隙微生物硝酸鹽反硝化脫氮代謝路徑所需酶及其相應(yīng)酶編碼(EC)如圖7所示,首先,硝酸鹽由硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運酶(Nrt)通過細(xì)胞膜運輸.然后,硝酸鹽在硝酸鹽還原酶(Nar和Nap)、亞硝酸鹽還原酶(Nir)、一氧化氮還原酶(Nor)和氧化亞氮還原酶(Nos)的作用下最終還原成氮氣,完成反硝化脫氮.該過程參與編碼的基因的豐度如表4所示.硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的基因豐度最高,分別為0.225%、0.230%,這表明硝酸鹽反硝化過程中,參與硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的微生物或酶較為豐富.亞硝酸鹽還原過程的基因豐度,表面微生物略高于間隙微生物,分別為0.065%、0.052%.對于一氧化氮還原過程的酶基因,表面與間隙微生物的豐度均為0.062%.硝酸鹽反硝化脫氮最后一步是氧化亞氮還原為氮氣,該過程中的酶基因在表面微生物中的豐度遠(yuǎn)低于間隙,分別為0.016%、0.061%.基于以上結(jié)果可以推測,在硫自養(yǎng)反硝化濾柱中,硫顆粒與間隙微生物存在著一定的協(xié)同作用.

圖7 硫氧化代謝通路

表4 各生物膜樣品中與反硝化代謝途徑相關(guān)的功能基因的豐度

2.3.2 硫代謝 硫代謝主要包括硫酸鹽的還原代謝和硫的氧化代謝,本研究只考慮后者.硫氧化的代謝途徑如圖7所示,包括S2-氧化生成為S0; S0、S2-、S2SO32-氧化為SO32-; S2SO32-氧化為SO42-; SO32-氧化為SO42-;以及S2SO32-分裂分解為S2-.

無論是S0、S2SO32-或是其它還原態(tài)硫的生物氧化,SO32-是硫氧化過程中必然的中間產(chǎn)物[26],且SO32-可以通過兩種途徑氧化生成SO42-.一種是SO32-直接氧化為SO42-,即SO32-在細(xì)胞色素C還原酶和末端色素系統(tǒng)催化氧化為硫酸鹽[27].另一種是通過APS(硫酸腺苷)途徑氧化,即細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的腺苷酰硫酸(APS)與在細(xì)胞膜上的APS還原酶發(fā)生的亞硫酸鹽氧化成硫酸鹽并與AMP相連接[28].

本研究未檢測到S0氧化為SO32-,S2-氧化為S0的基因.Rohwerder等研究發(fā)現(xiàn),微生物利用S0的過程中,S0首先被外膜蛋白上的硫醇基團(tuán)RSH活化為線狀的無機(jī)或有機(jī)多硫化物,然后被輸送到細(xì)胞質(zhì)中,由位于周質(zhì)區(qū)域內(nèi)的硫雙加氧酶(SDO)氧化成SO32-,最后氧化為SO42-[29].另外,需要說明的是目前關(guān)于硫氧化代謝的基因大都是基于好氧條件下硫氧化過程檢測到的功能基因,對于以硝酸鹽為電子受體的缺氧條件下的硫氧化過程的功能基因研究相對較少,該條件下單質(zhì)硫和其他還原態(tài)硫化物的酶促氧化可能與好氧條件下有所不同,由于缺乏大量的研究以及相應(yīng)的基因數(shù)據(jù)庫而導(dǎo)致本研究中硫氧化過程中一些功能基因檢測的缺失.

氧化硫代謝途徑相關(guān)的功能基因豐度如圖8所示,硫顆粒表面與間隙微生物中硫氧化代謝基因豐度較為接近.值得指出的是,對于SO32-氧化生成SO42-代謝,APS氧化途徑(EC.1.8.2.1)的基因豐度(0.137%、0.138%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接氧化途徑(EC.1.8.99.2)(0.0005%、0.0007%),表明元素硫自養(yǎng)反硝化作用中SO32-到SO42-的主要氧化途徑為APS氧化.

圖8 樣品中硫氧化代謝基因豐度

基于上述結(jié)果,可以推斷出硫元素自養(yǎng)反硝化柱中表面和間隙生物膜中的微生物存在協(xié)同效應(yīng).盡管如此,仍應(yīng)進(jìn)一步研究底物、微生物和基因表達(dá)的空間分布和關(guān)系,以全面了解元素硫自養(yǎng)反硝化的機(jī)制.

3 結(jié)論

3.1 Proteobacteria是硫顆粒表面與間隙微生物最豐富的門類.其中,下屬的β-proteobacteria豐度最高,其次是ε-proteobacteria、γ-proteobacteria、α- proteobacteria、δ-proteobacteria.

3.2 表面生物膜中的氮代謝基因豐度相對高于間隙生物膜.間隙生物膜中細(xì)胞外硝酸鹽和亞硝酸鹽運輸基因的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于表面生物膜.表面生物膜中參與異化還原和同化作用的基因豐度高于間隙生物膜,異化還原作用明顯高于同化作用.

3.3 在還原性反硝化代謝方面,表面生物膜的基因豐度明顯低于間隙生物膜,參與反硝化過程的基因豐度有明顯差異,尤其是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氧化亞氮還原為氮氣過程中的基因.

3.4 兩種生物膜中硫代謝的基因豐度沒有明顯差異.在亞硫酸鹽氧化為硫酸鹽的過程中,APS氧化途徑的基因豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于直接氧化途徑.

3.5 硫自養(yǎng)反硝化濾柱中,硫顆粒與間隙微生物在氮異化還原代謝與SO32-氧化中存在協(xié)同作用.

[1] Bordeleau G, Savard M M, Martel R, et al. Determination of the origin of groundwater nitrate at an air weapons range using the dual isotope approach [J]. Journal of Contaminant Hydrology, 2008,98(3/4):97- 105.

[2] Qian J, Lu H, Cui Y, et al. Investigation on thiosulfate-involved organics and nitrogen removal by a sulfur cycle-based biological wastewater treatment process [J]. Water Research, 2015,69:295-306.

[3] Sahinkaya E, Kilic A, Duygulu B. Pilot and full scale applications of sulfur-based autotrophic denitrification process for nitrate removal from activated sludge process effluent [J]. Water Research, 2014, 60:210-217.

[4] 周 婭,買文寧,代吉華,等.硫代硫酸鈉聯(lián)合硫鐵礦自養(yǎng)反硝化脫氮性能[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2020,40(5):2081-2086.

Zhou Y, Mai W N, Dai J H, et al. Study on autotrophic denitrification performance of sodium thiosulfate combined with pyrite system [J]. China Environmental Science, 2020,40(5):2081-2086.

[5] Zhao Y, Zhang B, Feng C, et al. Behavior of autotrophic denitrification and heterotrophic denitrification in an intensified biofilm-electrode reactor for nitrate-contaminated drinking water treatment [J]. Bioresource Technology, 2012,107:159-165.

[6] Sahinkaya E, Yurtsever A, Aktas O, et al. Sulfur-based autotrophic denitrification of drinking water using a membrane bioreactor [J]. Chemical Engineering Journal, 2015,268(1):180-186.

[7] Luna-Velasco A, Sierra-Alvarez R, Castro B, et al. Removal of nitrate and hexavalent uranium from groundwater by sequential treatment in bioreactors packed with elemental sulfur and zero-valent iron [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2010,67(2):933-942.

[8] Zhang L, Zhang C, Hu C, et al. Denitrification of groundwater using a sulfur-oxidizing autotropic denitrifying anaerobic fluidized-bed MBR: Performance and bacterial community structure [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015,99:2815-2827.

[9] Lv X, Shao M, Li J, et al. Nitrate removal with lateral flow sulphur autotrophic denitrification reactor [J]. Environmental Technology, 2014,35(21):2692-2697.

[10] Kong Z, Li L, Feng C, et al. Comparative investigation on integrated vertical-flow biofilters applying sulfur-based and pyrite-based autotrophic denitrification for domestic wastewater treatment [J]. Bioresource Technology, 2016,211:125-135.

[11] Cortez S, Teixeira P, Oliveira R, et al. Denitrification of a landfill leachate with high nitrate concentration in an anoxic rotating biological contactor [J]. Biodegradation, 2011,22:661-671.

[12] Fu C X, Li J, Lv X M, et al. Operation performance and microbial community of sulfur-based autotrophic denitrification sludge with different sulfur sources [J]. Environmental Geochemistry and Health, 2020,42(3):1009-1020.

[13] Almeida C, Azevedo N F, Santos S, et al. Discriminating multi- species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH) [J]. Plos One, 2011,6(3):e147863.

[14] Okabe S, Naitoh H, Satoh H, et al. Structure and function of nitrifying biofilms as determined by molecular techniques and the use of microelectrodes [J]. Water Science and Technology, 2002,46(1/2): 233-241.

[15] Sun F Y, Dong W Y, Shao M F, et al. Aerobic methane oxidation coupled to denitrification in a membrane biofilm reactor: Treatment performance and the effect of oxygen ventilation [J]. Bioresource Technology, 2013,145:2-9.

[16] 張 超,陶華強(qiáng),宋圓圓,等.硫自養(yǎng)填充床反應(yīng)器降解水中高濃度高氯酸鹽的特性及菌群分析 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2017,38(1):247-252.

Zhang C, Tao H Q, Song Y Y, et al. Characteristics of perchlorate reduction and analysis of consortium structurein a sulfur-based reactor at a high perchlorate concentration [J]. Environmental Science, 2017, 38(1):247-252.

[17] 萬東錦,李 琦,劉永德,等.硫自養(yǎng)反硝化過程中含硫副產(chǎn)物產(chǎn)生規(guī)律及微生物群落結(jié)構(gòu)的空間分布 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2018,31(6): 1152-1159.

Wan D J, Li Q, Liu Y D, et al. Production rule of sulfur by-products in sulfur autotrophic denitrification and microbial community special distribution analysis [J]. Research of Environmental Sciences, 2018, 31(6):1152-1159.

[18] 鄭照明,楊函青,馬 靜,等.SNAD反應(yīng)器中顆粒污泥和絮體污泥脫氮特性[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(10):2996-3002.

Zheng Z M, Yang H Q, Ma J, et al. The nitrogen removal performance of granules and flocs in SNAD reactor [J]. China Environmental Science, 2015,35(10):2996-3002.

[19] 馬瀟然,鄭照明,卞 偉,等.硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)運行效能和微生物群落結(jié)構(gòu)研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2020,40(10):4335-4341.

Ma X R, Zheng Z M, Bian W, et al. Study on operation efficiency and microbial community structure of sulfur-based autotrophic denitrification system [J]. China Environmental Science, 2020,40(10): 4335-4341.

[20] Fernandez N, Sierra-Alvarez R, Field J A, et al. Microbial community dynamics in a chemolithotrophic denitrification reactor inoculated with methanogenic granular sludge [J]. Chemosphere, 2008,70(3): 462-474.

[21] 趙 晴,楊偉明,王 瑤,等.硫化物自養(yǎng)反硝化細(xì)菌顆粒污泥及其物化特征[J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2017,11(6):3884-3890.

Zhao Q, Yang W M, Wang Y, et al. Granulation and physical chemical characterization of sulfur-oxidizing bacteria sludge [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2017,11(6):3884- 3890.

[22] An S, Tang K, Nemati M. Simultaneous biodesulphurization and denitrification using an oil reservoir microbial culture: Effects of sulphide loading rate and sulphide to nitrate loading ratio [J]. Water Research, 2010,44(5):1531-1541.

[23] Rotaru A E, Shrestha P M, Liu F, et al. Direct interspecies electron transfer betweenand[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014,80(15): 4599-4605.

[24] Huang L, Liu X, Tang J, et al. Electrochemical evidence for direct interspecies electron transfer betweenand[J]. Bioelectrochemistry, 2019,127:21-25.

[25] Wang Y, Bott C, Nerenberg R. Sulfur-based denitrification: Effect of biofilm development on denitrification fluxes [J]. Water Research, 2016,100:184-193.

[26] Kappler U, Bennett B, Rethmeier J, et al. Sulfite: Cytochrome coxidoreductase frompurification, characterization, and molecular biology of a heterodimeric member of the sulfite oxidase family [J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(18): 13202-13212.

[27] Takeuchi T L, Suzuki I. Effect of pH on sulfite oxidation bycells with sulfurous acid or sulfur dioxide as a possible substrate [J]. Journal of Bacteriology, 1994,176(3):913-916.

[28] Kappler U, Dahl C. Enzymology and molecular biology of prokaryotic sulfite oxidation [J]. Fems Microbiology Letters, 2001,203(1):1-9.

[29] Rohwerder T, Sand W. The sulfane sulfur of persulfides is the actual substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and Acidiphiliumspp [J]. Microbiology-SGM, 2003,149(7):1699-1709.

Community structure and gene distribution of the surface and interstitial biofilm in the particle sulfur autotrophic denitrification.

Lü Xiao-mei, WU Yi-cong, CHEN Gui-lian, XU Jian-hui, LIU Peng, HU jun-jie*

(Dongguan University of Technology, Dongguan 523808, China)., 2022,42(6)：2764～2770

Bioinformation including microbial community structure, functional genes and metabolic pathways of surface and interstitial biofilms in the particle elemental sulfur autotrophic denitrification column were investigated in the present study. Bacterial diversity of microorganisms in the surface biofilm of sulfur particles was lower than that of interstitial biofilm. Differences in the abundance of functional genes for nitrogen metabolism were significant. Abundance of extracellular nitrate and nitrite transportation genes in the interstitial biofilm was much higher than that in the surface biofilm, with the abundance of 0.0792%, 0.109% and 0.0157%, 0.0314%. For reductive denitrification metabolism, the total gene abundance in surface biofilm was significantly lower than that in interstitial biofilm, with their abundance of 0.367%、0.406% respectively. Moreover, abundances of genes participated in denitrification process were remarkably different, especially the genes in the process of reducing nitrate to nitrite and nitrous oxide to nitrogen gas. Regarding sulfur metabolism, no obvious difference was observed. APS (adenosyl phosphosulfate) oxidation was the major pathway for oxidation of sulfite to sulfate, with its gene abundance was much higher than the direct oxidation pathway, and their abundances were 0.137% and 0.0005% (surface), 0.138% and 0.0007% (interstitial). Results indicated that microorganisms in interstitial biofilms cooperated with that in the surface biofilms, contributing to sulfur autotrophic denitrification synergistically.

sulfur autotrophic denitrification；biofilm；community structure；functional gene

X172

A

1000-6923(2022)06-2764-07

呂小梅(1984-),女,湖北襄陽人,博士,主要從事環(huán)境污染物生物治理與修復(fù)技術(shù)研究.發(fā)表論文50余篇.

2021-11-23

廣東省自然科學(xué)基金項目(2019A1515110750,2021B1515140023);東莞市社會發(fā)展科技重點項目(2020507140150,20211800904652, 20211800905532)

* 責(zé)任作者, 副教授, hujunjie022@126.com