111例無菌體液標(biāo)本中CRE的碳青霉烯酶檢測及同源性分析*

周文艷，張 華△，許永杰

1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州遵義 563000；2.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴州貴陽 550000

抗菌藥物在治療細菌感染方面發(fā)揮了巨大的作用，但隨著抗菌藥物的大量使用，細菌耐藥問題也日漸嚴(yán)重[1]。耐藥菌的出現(xiàn)給患者及家庭帶來極大的經(jīng)濟負擔(dān)，且威脅患者生命健康[2]。碳青霉烯類抗菌藥物可與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合并阻止肽聚糖合成，導(dǎo)致細胞裂解死亡[3]。因該藥具有抗菌譜廣、毒性相對較低、不產(chǎn)生交叉耐藥等特點，被認為是治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的首選藥物[4]。因近年來碳青霉烯類抗菌藥物使用增加，耐碳青霉烯類抗菌藥物的細菌也隨之增加，而耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的出現(xiàn)成為關(guān)注的焦點[5]?；颊吒腥驹摼笈R床可用藥物少，病死率高，尤其是在無菌體液中檢出的CRE，絕大多數(shù)為侵襲性感染，治療藥物更有限，病死率更高[6]。因此，本研究主要分析貴州省人民醫(yī)院(以下簡稱本院)2019年6月至2021年6月收集的無菌體液標(biāo)本中CRE的耐藥情況和同源性，旨在為本院院內(nèi)感染防控和臨床合理用藥提供參考依據(jù)，預(yù)防及減少CRE的產(chǎn)生。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2019年6月至2021年6月門診及住院患者送檢的無菌體液標(biāo)本中檢出的111株CRE為研究對象，剔除同一患者相同標(biāo)本類型的重復(fù)菌株。藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，碳青霉烯抑制劑增強試驗質(zhì)控菌株為經(jīng)測序攜帶blaKPC的肺炎克雷伯菌、攜帶blaNDM的大腸埃希菌，脈沖場凝膠電泳質(zhì)控菌株為沙門菌H9812，所有質(zhì)控菌株均為本實驗室保存。

1.2CRE的判定 對亞胺培南、美羅培南、厄他培南其中任意一種碳青霉烯類藥物耐藥的腸桿菌科細菌。

1.3儀器與試劑 BD phoenix-100細菌鑒定藥敏儀(美國BD公司)，VITEK-2全自動細菌鑒定藥敏儀及配套試劑(法國梅里埃公司)；脈沖場凝膠電泳儀及配套設(shè)備(美國伯樂公司)，恒溫水浴箱及恒溫振蕩器(常州奧華儀器有限公司)，脈沖場電泳小膠塊清洗器(成都蘭博易生物科技有限公司)。亞胺培南和美羅培南藥敏試驗紙片(上海賽默飛有限公司)；哥倫比亞血平板、MH平板(廣州迪景科技有限公司)；Seakem gold瓊脂糖(美國Lonza公司)，XbaⅠ內(nèi)切酶(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，蛋白酶K(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)，NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶檢測試劑盒(長沙復(fù)星診斷科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1細菌鑒定及藥敏 采用BD phoenix-100或VITEK-2全自動細菌鑒定藥敏儀進行細菌鑒定及藥敏試驗，K-B法或E-test法對藥敏結(jié)果進行復(fù)核，抗菌藥物敏感性判定參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會2020年發(fā)布的藥敏試驗折點標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2表型和基因型檢測 碳青霉烯酶表型檢測和基因型檢測分別采用文獻[7]中推薦的碳青霉烯酶抑制劑增強試驗和膠體金免疫層析法。

1.4.3同源性分析 應(yīng)用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對91株肺炎克雷伯菌株進行同源性分析，將細菌培養(yǎng)18～20 h，采用比濁儀將待測菌調(diào)為3.7～4.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木?，加入蛋白酶K，1%Seakem Gold，混勻制備膠塊；用細胞裂解液在56 ℃水浴搖床中裂解3 h；56 ℃的TE緩沖液重復(fù)清洗膠塊10次；加入含XbaⅠ內(nèi)切酶的酶切混合液，37 ℃水浴孵育2 h后進行脈沖場凝膠電泳；電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色30 min，再脫色20 min，放入凝膠成像儀拍照。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用WHONET5.6軟件統(tǒng)計CRE的耐藥情況；采用SPSS21.0軟件進行標(biāo)本類型、菌株種類、科室分布等統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示；應(yīng)用BioNumerics軟件對PFGE結(jié)果進行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本類型 CRE來源的無菌體液標(biāo)本類型以血液標(biāo)本[55.9%(62/111)]為主，其次為腹水[25.2%(28/111)]、胸腔積液[8.1%(9/111)]、腦脊液[3.6%(4/111)]、盆腔積液[1.8%(2/111)]、膽汁[0.9%(1/111)]、腹腔引流液[0.9%(1/111)]、髂窩引流液[0.9%(1/111)]，以及其他無菌體液[2.7%(3/111)]。

2.2菌株的種類 111株CRE菌株中，檢出率位于前3位的分別是肺炎克雷伯菌[82.0%(91/111)]、大腸埃希菌[10.8%(12/111)]、產(chǎn)酸克雷伯菌[3.6%(4/111)]，其余檢出的細菌有臭鼻克雷伯菌[1.8%(2/111)]、產(chǎn)氣腸桿菌[0.9%(1/111)]、陰溝腸桿菌[0.9%(1/111)]。

2.3菌株的科室來源 CRE來源的科室分布中，肝膽外科分離出來的CRE最多，其次為重癥監(jiān)護病房(ICU)、血液內(nèi)科、呼吸內(nèi)科重癥監(jiān)護病房(RICU)、泌尿外科，見表1。

表1 菌株的科室來源

2.4藥敏結(jié)果 CRE對大多數(shù)抗菌藥物耐藥，對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率較高，多高達100.0%；對頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、氯霉素耐藥率較低，分別為85.3%、80.0%、87.2%，見表2。

表2 CRE對抗菌藥物的耐藥率

2.5菌株的碳青霉烯酶表型和基因型分布 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測CRE的碳青霉烯酶表型，結(jié)果顯示,肺炎克雷伯菌主要攜帶絲氨酸酶，大腸埃希菌主要攜帶金屬酶。膠體金免疫層析試驗檢測CRE攜帶碳青霉烯酶類型，結(jié)果顯示，108株(97.3%)攜帶碳青霉烯酶，其中94株(84.7%)攜帶KPC碳青霉烯酶，13株(11.7%)攜帶NDM碳青霉烯酶，1株攜帶IMP碳青霉烯酶，1株同時攜帶IMP和NDM碳青霉烯酶，未檢測出OXA-48、VIM碳青霉烯酶；肺炎克雷伯菌主要攜帶KPC碳青霉烯酶[96.7%(88/91)]，大腸埃希菌主要攜帶NDM碳青霉烯酶[83.4%(10/12)]，見表3、表4。

表3 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗結(jié)果[n(%)]

表4 膠體金免疫層析試驗

2.6菌株的同源性分析 將PFGE條帶圖譜進行分析，并將具有85%相似度的菌株判定為同一型，具體分型標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[8]：兩菌株條帶的大小數(shù)目完全相同表示是同一菌株；有1～3條條帶不同表示屬于不同亞型；4～6條條帶不同表示可能相關(guān)，7條及以上條帶不同表示不相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，91株肺炎克雷伯菌可分為A～O 15個型，其中A型62株，除PICU、門診、康復(fù)科未發(fā)現(xiàn)A型菌株外，其余科室均檢出該種菌株，時間為2019年6月至2021年6月；B型有8株，主要集中在肝膽外科，ICU和腎內(nèi)科各有1株，檢出時間為2020年11月至2021年1月，見圖1。其他型別菌株數(shù)量較少，呈散在分布。聚類分析圖分析結(jié)果顯示，肝膽外科病區(qū)分離出來的菌株主要有5型，A型25株(71.4%)，B型6株(17.1%)，C型1株(2.9%)，D型2株(5.7%)，G型1株(2.9%)。ICU分離出來的菌株有6型，其中A型14株(58.3%)，E型3株(14.3%)，B型、D型、K型、M型各1株。血液內(nèi)科檢出CRE有兩種型別，其中A型6株，N型1株，其余各科室呈散在分布。

注：M為質(zhì)控菌株沙門菌H9812；8470、8363、8409、8314、8246、8217、8313、8305、8285、8283、8273為本實驗室細菌編號。圖1 部分CRE的PFGE電泳圖

3 討 論

CRE是引起嚴(yán)重感染的重要病原體，如血流感染、肺部感染、復(fù)雜的腹腔感染等[9]。 據(jù)2020年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)結(jié)果顯示，2005-2018年，腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率持續(xù)上升，尤其是肺炎克雷伯菌，對美羅培南的耐藥率更是從2.9%上升至26.3%，近2年雖有所下降，但仍處于較高水平[10]，CRE治療難度大，病死率高，嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生安全[11]。CRE被定義為對任意一種碳青霉烯類藥物耐藥或者攜帶碳青霉烯酶的一類腸桿菌科細菌[12]。因?qū)嶒灄l件限制，本研究2019年6月至2020年9月未做厄他培南藥敏試驗，因此CRE檢出率可能比實際偏低。

本研究中CRE主要來源于血液標(biāo)本，其次為腹水、胸腔積液等無菌體液標(biāo)本，與楊玉琪等[13]結(jié)果相似。CRE的菌株類型主要為肺炎克雷伯菌，其次為大腸埃希菌，其余菌株較少，與郭普等[14]研究結(jié)果符合?；颊吣挲g大、住院時間長、有基礎(chǔ)疾病尤其是心臟及肺部疾病，以及長期使用廣譜抗菌藥物、接受過有創(chuàng)操作、使用過免疫抑制劑等都是感染CRE的危險因素[15-17]。本研究中的CRE主要來源于肝膽外科，可能與肝膽外科患者肝功能較差，以及肝移植患者服用免疫抑制劑，導(dǎo)致機體免疫力低有關(guān)。CRE檢出較多的科室其次為ICU，可能與ICU患者病情普遍較重、住院時間長、廣譜抗菌藥物使用多、相對其他科室有創(chuàng)操作較多等因素有關(guān)。

本研究中CRE耐藥情況嚴(yán)重，對頭孢哌酮/舒巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、氯霉素耐藥率較低，臨床醫(yī)生可根據(jù)藥敏結(jié)果合理用藥。目前，治療CRE的藥物有限，最常用的有多黏菌素和替加環(huán)素，但它們有較大的毒性，并且可能使耐藥性增加[18]。更嚴(yán)重的是，2018年我國報道了一種對碳青霉烯類抗菌藥物、多黏菌素、替加環(huán)素都耐藥的CRE菌株，這種菌株的出現(xiàn)，使CRE的感染無藥可用，大大增加了CRE治療的難度[19]。

CRE可以通過多種機制產(chǎn)生耐藥，但最主要的機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，尤其是在我國，約90%的CRE攜帶產(chǎn)碳青霉烯酶基因[20]。有研究表明，患者感染產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE病死率高于感染其他類型的CRE[21]。因此，需要重點關(guān)注CRE菌株攜帶碳青霉烯酶情況。碳青霉烯酶按Ambler分類可分為 A、B 和 D 類3類，A類和D類為絲氨酸酶，B類為金屬酶。其中A類絲氨酸酶KPC是世界范圍內(nèi)最流行的碳青霉烯酶[22]。NDM是流行程度僅次于KPC的碳青霉烯酶，于2009年在肺炎克雷伯菌中被分離出來[23]。我國檢出最多的碳青霉烯酶為KPC，其次為NDM，部分地區(qū)有少量IMP、VIM、OXA-48等產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的報道[23-24]。有研究證明，頭孢他啶-阿維巴坦對產(chǎn)KPC和 OXA-48型絲氨酸酶的菌株有較高抗菌活性，但對產(chǎn)金屬-β-內(nèi)酰胺酶的菌株無抗菌活性[25]，而B類金屬-β-內(nèi)酰胺酶往往對氨曲南敏感，因此氨曲南/阿維巴坦復(fù)方制劑常用于由產(chǎn)金屬酶的CRE引起的嚴(yán)重感染[26]。本研究中97.3%的CRE菌株攜帶碳青霉烯酶，高于ZHANG等[20]的研究結(jié)果，這可能與本研究中標(biāo)本排除了痰液、尿液、糞便等非無菌體液標(biāo)本有關(guān)，也可能與實驗標(biāo)本數(shù)量少有關(guān)；其余CRE菌株未檢測到碳青霉烯酶，可能存在其他耐藥機制，如合并其他β-內(nèi)酰胺酶高表達(AmpC酶和ESBL酶)或者膜孔蛋白缺失等，需要后期進一步研究。

碳青霉烯酶抑制劑增強試驗是一種簡單易行的檢測CRE產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬-β-內(nèi)酰胺酶表型的方法。任艷麗等[27]將128株CRE碳青霉烯酶抑制劑增強試驗的結(jié)果通過基因檢測進行驗證，結(jié)果完全符合。本研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌主要攜帶絲氨酸酶，大腸埃希菌主要攜帶金屬酶。膠體金免疫層析是一項可以快速、準(zhǔn)確檢測CRE攜帶碳青霉烯酶類型的技術(shù)，對臨床感染CRE患者尤其是重癥患者早期檢測CRE產(chǎn)碳青霉烯酶類型并針對性用藥十分重要[7]。有研究表明，相對于經(jīng)典的PCR檢測方法，免疫膠體金技術(shù)的靈敏度及特異度高達100%[28]。此外，本研究結(jié)果顯示，97.3%的CRE菌株攜帶碳青霉烯酶，主要為KPC，其次為NDM，其中96.7%的肺炎克雷伯菌攜帶KPC，83.4%的大腸埃希菌攜帶NDM，與任艷麗等[27]研究結(jié)果相似。本研究中有2株CRE菌株表型試驗為絲氨酸酶陽性但膠體金免疫層析法未檢測到碳青霉烯酶，可能與膠體金免疫層析法只能檢測KPC、NDM、IMP、VIM、OXA-48共5種常見碳青霉烯酶而無法檢測其他罕見的碳青霉烯酶有關(guān)。表型檢測和膠體免疫層析法結(jié)果不符合的需要后期進一步采用PCR擴增其他罕見基因來驗證。

本研究中91株肺炎克雷伯菌可分共15個型。其中A型菌株數(shù)量最多，分布科室最廣，表明A型菌株是院內(nèi)最主要的流行菌株。B型菌株共8株，但檢出時間僅在連續(xù)的3個月內(nèi)，提示該菌株在該時間段引起過短暫流行。CRE檢出率在肝膽外科、ICU、血液內(nèi)科檢出率較高，且A型占比較高，提示菌株間的親緣性較高，可能存在克隆性傳播，需要注意院感防控，加強隔離和環(huán)境消毒。少數(shù)不同科室不同患者檢測出相似度為100%的同種菌株，提示科室之間可能存在交叉感染，需注意不同科室之間患者轉(zhuǎn)科的管理等。

綜上所述，CRE的播散較快，且目前可用藥物少，治療難度大。因此，應(yīng)建立有效的檢測體系，同時建立早期主動篩查機制，對耐藥菌進行科學(xué)、專業(yè)化管理。同時應(yīng)加強院感防控，強化醫(yī)務(wù)人員院感防控意識，規(guī)范各項醫(yī)療操作。