基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制

張 進(jìn) 王 東

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院SICU，北京 100020；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院骨科，北京 100020)

骨折是造成傷殘的重要原因。由于骨折愈合過(guò)程復(fù)雜，雖然嚴(yán)格按照診療規(guī)范進(jìn)行骨折復(fù)位、固定，仍有約10%的患者出現(xiàn)骨折延遲愈合甚至骨折不愈合[1-3]。一旦患者骨折不愈合，往往需要進(jìn)行二次手術(shù)，即使術(shù)后骨折愈合，但患者功能恢復(fù)困難，嚴(yán)重影響生活、工作。尋找促進(jìn)骨折愈合的方法一直是創(chuàng)傷骨科研究的重點(diǎn)[4-6]。

目前直接促進(jìn)骨折愈合的生物制劑有限。雖然骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)被美國(guó)批準(zhǔn)用于臨床[7]，但易出現(xiàn)異位骨化，有研究[8-9]顯示，BMP-2會(huì)增加術(shù)后內(nèi)固定物失敗，部分患者應(yīng)用BMP-2后會(huì)出現(xiàn)危及生命的并發(fā)癥。局部高劑量應(yīng)用BMP-2會(huì)有誘發(fā)惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

續(xù)斷是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》命名為續(xù)斷并沿用至今。續(xù)斷又稱川斷、和尚頭，因?yàn)榭梢浴袄m(xù)折接骨”所以稱之為“續(xù)斷”?！侗静萁?jīng)集注》上記載“廣州又有一藤名續(xù)斷，一名諾藤，斷其莖，器承其汁飲之，療虛損絕傷，用沐頭，又長(zhǎng)發(fā)”[10]。

《植物名實(shí)圖考》[10]詳細(xì)描述了續(xù)斷的形態(tài)，并進(jìn)行繪圖備注。描述續(xù)斷為“滇中生一種續(xù)斷，極似芥菜，亦多刺，與大薊類似。稍端夏出一苞，黑刺如毬，大如千日紅花苞，開花白，宛如蔥花，莖勁，經(jīng)冬不折，土醫(yī)習(xí)用。滇蜀密布，疑川中販者即此種，繪之備考，原圖俱別存”。又對(duì)之前本草記載進(jìn)行分析，指出之前記載有誤。

《滇南本草》中對(duì)續(xù)斷描述為“入肝補(bǔ)肝，強(qiáng)筋骨，走經(jīng)絡(luò)，止經(jīng)中酸痛，安胎，治婦人白帶，生新血，破瘀血，落死胎，止咳嗽，咳血，治赤白便濁”[10]。續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的研究較多，但是其機(jī)制不清，闡明其作用機(jī)制，可為臨床推廣續(xù)斷治療骨折以及開發(fā)新藥物提供研究思路。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制進(jìn)行探討。首先根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)分析續(xù)斷的有效成分以及篩選其治療骨折的作用基因靶點(diǎn)。然后對(duì)基因靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，得到續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的重要信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)作用基因靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，得到續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的關(guān)鍵基因。最后通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證續(xù)斷調(diào)控關(guān)鍵基因的機(jī)制，以及可能結(jié)合的位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 續(xù)斷有效成分篩選以及作用靶點(diǎn)獲取

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索續(xù)斷的化學(xué)成分，設(shè)定口服藥物生物利用度(oral drug bioavailability,OB)≥30%和類藥性指數(shù)(drug like index, DL)≥0.18作為篩選續(xù)斷有效活性成分的標(biāo)準(zhǔn)[11]。通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)得到續(xù)斷有效活性成分的作用靶點(diǎn)，并利用UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)將作用靶點(diǎn)名稱(target name)轉(zhuǎn)換成基因名稱(gene name)。

1.2 續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)篩選

以骨折“bone fracture”作為關(guān)鍵詞，在TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(http://www.omim.org/)、GeneCards(http://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，獲取骨折的相關(guān)基因靶點(diǎn)[12-16]。整合上述數(shù)據(jù)庫(kù)的骨折靶點(diǎn)，刪除重復(fù)基因。將續(xù)斷有效成分的作用基因靶點(diǎn)與骨折的相關(guān)基因靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲取交集。通過(guò)EVenn(http://www.ehbio.com/test/venn/#/)軟件繪制韋恩圖[17]。

1.3 續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)GO以及KEGG富集分析

將獲取的續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定種屬為人類，進(jìn)行GO以及KEGG富集分析[18-19]。獲取續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分、信號(hào)通路。

1.4 續(xù)斷治療骨折的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及關(guān)鍵基因篩選

將續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5(https://www.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)[20-21]。設(shè)定相互作用最低值為0.4，構(gòu)建續(xù)斷治療骨折的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出.tsv格式文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2(https://cytoscape.org/)軟件，通過(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)degree以及betweenness參數(shù)，分別選取前5位基因，獲取交集得到網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因[22-23]。

1.5 分子對(duì)接

將續(xù)斷治療骨折的關(guān)鍵基因作為受體，續(xù)斷中OB前3位有效成分作為配體。通過(guò)PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢得到續(xù)斷治療骨折的關(guān)鍵基因分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)出.pdb格式文件[24]。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出續(xù)斷中OB前3位的有效成分分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)出為.mol2格式文件。將受體分子結(jié)構(gòu)即關(guān)鍵基因分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Pymol(https://pymol.org/2/)軟件，去除水分子和配體結(jié)構(gòu)，得到受體結(jié)構(gòu)[25]。將受體與配體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock 4.2(http://autodock.scripps.edu/downloads)軟件進(jìn)行分子對(duì)接并分析得到最低結(jié)合能。同時(shí)導(dǎo)出.pdbqt格式文件。將文件導(dǎo)入Pymol軟件，顯示受體與配體結(jié)合氫鍵、結(jié)合位點(diǎn)以及確定定活性口袋，并將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 續(xù)斷有效成分以及作用靶點(diǎn)

通過(guò)設(shè)定OB≥30%和DL≥0.18，得到續(xù)斷有效成分為8個(gè)(表1)，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到作用靶點(diǎn)63個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到作用靶點(diǎn)53個(gè)。

表1 續(xù)斷有效成分

2.2 續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、PharmGkb等數(shù)據(jù)庫(kù)查詢骨折相關(guān)作用靶點(diǎn)，共得到5 115個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)(圖1)。其中TTD與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)未查詢到與骨折相關(guān)靶點(diǎn)。將骨折相關(guān)靶點(diǎn)與續(xù)斷的作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲取交集得到34個(gè)續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)(圖2)。

圖1 各數(shù)據(jù)庫(kù)骨折相關(guān)作用基因靶點(diǎn)

圖2 續(xù)斷作用靶點(diǎn)與骨折相關(guān)基因靶點(diǎn)交集

2.3 續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)GO以及KEGG富集分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定參與的效應(yīng)P值小于0.05，參與的基因至少2個(gè)。分析得到續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程有76個(gè)，其中前10位為：藥物反應(yīng)、缺乏配體的外部凋亡信號(hào)通路、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、晝夜節(jié)律、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、gamma-氨基丁酸信號(hào)通路、線粒體釋放細(xì)胞色素c、對(duì)輻射的反應(yīng)以及行為恐懼反應(yīng)等。參與的細(xì)胞成分有20個(gè)，其中前10位為：胞質(zhì)、GABA-A受體復(fù)合物、突觸后、神經(jīng)元投射、等離子體膜、線粒體外膜、氯離子通道復(fù)合體、膜筏、線粒體以及pore復(fù)合體等。參與的分子功能有20個(gè)，其中前10位為：蛋白質(zhì)同源二聚化活性、GABA-A受體活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、相同蛋白的結(jié)合、酶結(jié)合、前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性、BH3域結(jié)合、GABA門控氯離子通道活性以及芳香酯活性等，詳見表2。

表2 續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果

KEGG富集分析顯示，治療骨折的作用基因靶點(diǎn)參與的信號(hào)通路有44個(gè)，其中前10位為：癌癥相關(guān)信號(hào)通路、結(jié)直腸癌相關(guān)信號(hào)通路、激活神經(jīng)的受體配體結(jié)合相關(guān)信號(hào)通路、嗎啡成癮相關(guān)信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、內(nèi)源性大麻素逆行信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞中脂肪分解調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路等，詳見表3。

表3 續(xù)斷治療骨折的作用基因靶點(diǎn)KEGG富集分析結(jié)果

2.4 續(xù)斷治療骨折的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及關(guān)鍵基因

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定相互作用最低值為0.4，構(gòu)建續(xù)斷治療骨折的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，共納入34個(gè)基因，79個(gè)連接。平均degree參數(shù)為4.65，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)富集P值小于1.0e-16(圖3)。導(dǎo)入Cytoscape軟件，計(jì)算degree以及betweenness參數(shù)，degree參數(shù)前5位基因?yàn)椋篔UN、PTGS2、HSP90AA1、MAPK14、CASP8。betweenness參數(shù)前5位基因?yàn)椋篛PRM1、MAPK14、PTGS2、HSP90AA1、PGR。獲取交集得到續(xù)斷治療骨折的關(guān)鍵基因?yàn)镻TGS2、HSP90AA1、MAPK14(圖4，圖中黃色為關(guān)鍵基因)。

圖3 續(xù)斷治療骨折的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 續(xù)斷治療骨折的關(guān)鍵基因

2.5 分子對(duì)接

將續(xù)斷治療骨折的關(guān)鍵基因：PTGS2、HSP90AA1、MAPK14作為受體，將續(xù)斷中OB前3位的有效成分：Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid等作為配體。通過(guò)Pymol、Autodock等開源軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，各小分子均能與配體進(jìn)行結(jié)合。選取結(jié)合能最低值的結(jié)合位置進(jìn)行分析，測(cè)量結(jié)合氫鍵距離以及結(jié)合位點(diǎn)(表4、圖5、圖6)。

圖5 各配體受體結(jié)合位點(diǎn)

圖6 各配體受體結(jié)合區(qū)域

表4 各配體受體最低結(jié)合能

3 討論

續(xù)斷是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，因?yàn)榫哂小袄m(xù)折接骨”的作用而得名，但其促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制不清，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》上出現(xiàn)。歷代本草典籍中以續(xù)斷為正名，別名較多，如“屬折”、“接骨”、“續(xù)斷藤”、“接骨木”、“馬薊”、“大薊”等。根據(jù)續(xù)斷的產(chǎn)地別名又有區(qū)別，如貴州、云南稱之為“山蘿卜”，四川為“川蘿卜根”，湖北為“黑老鴉頭”、“小續(xù)斷”等[10]。

歷代本草典籍中關(guān)于續(xù)斷的記載又略有不同，其中有些可能是將其他植物誤以為是續(xù)斷。清代《植物名實(shí)圖考》中對(duì)續(xù)斷進(jìn)行了詳細(xì)描述，并進(jìn)行繪圖。并指出之前典籍存在錯(cuò)誤，如書中記載“此藥習(xí)用，并非珍品，不識(shí)前人何以未能的識(shí)”[10]。表明從清代開始，川續(xù)斷成為續(xù)斷的唯一正品來(lái)源。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP進(jìn)行檢索，按照OB和DL這兩個(gè)反映藥物被吸收利用程度的指標(biāo)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷有效成分共有8個(gè)，分別為Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid、Sylvestroside Ⅲ、Japonine、Cauloside A_qt、beta-sitosterol、sitosterol。目前尚無(wú)這些化合物調(diào)控骨折愈合的研究報(bào)道。為此，筆者通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)繼續(xù)檢索，刪除重復(fù)作用基因靶點(diǎn)，最終得到上述8種化合物的作用基因靶點(diǎn)53個(gè)。將這些作用靶點(diǎn)與骨折愈合相關(guān)的基因進(jìn)行交集分析，發(fā)現(xiàn)有34個(gè)可能的作用靶點(diǎn)，這些基因?yàn)榉治隼m(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

對(duì)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)同源二聚化活性、GABA-A受體活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、相同蛋白的結(jié)合、酶結(jié)合、前列腺素-內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性、BH3域結(jié)合、GABA門控氯離子通道活性以及芳香酯活性等這些分子功能可能是續(xù)斷調(diào)控骨折愈合的重要機(jī)制。這些受體以及酶活性是骨折愈合的基礎(chǔ)，但是具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建續(xù)斷治療骨折的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選得到續(xù)斷治療骨折的關(guān)鍵基因?yàn)镻TGS2、HSP90AA1、MAPK14。Kong等[26]分析微重力刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞調(diào)控骨折愈合的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)微重力促進(jìn)血管形成可能與MAPK信號(hào)通路有關(guān)。筆者之前的研究也發(fā)現(xiàn)MAPK14基因可能與骨折愈合過(guò)程中血管形成有關(guān)[1]。激活腺苷受體A2A會(huì)上調(diào)激活骨折組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK14表達(dá)。Camal Ruggieri等[27]總結(jié)與骨折愈合相關(guān)的信號(hào)通路，提出MAPK信號(hào)通路激活是機(jī)械傳導(dǎo)促進(jìn)骨修復(fù)的基礎(chǔ)。超聲波促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化以及骨修復(fù)可能與上調(diào)MAPK有關(guān)。Sharma等[28]分析神經(jīng)纖維瘤蛋白缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路過(guò)度激活可能是小鼠脛骨骨折不愈合的關(guān)鍵。所以MAPK通路調(diào)控骨折愈合的機(jī)制復(fù)雜，過(guò)度激活或者抑制激活可能均會(huì)導(dǎo)致骨折不愈合。目前關(guān)于PTGS2與骨折愈合的研究較少。陳建泉等[29]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討女貞子治療骨質(zhì)疏松性骨折的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PTGS2是參與促進(jìn)骨折愈合的主要信號(hào)通路?，F(xiàn)尚未查到有關(guān)于HSP90AA1與骨折愈合的報(bào)道。

通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，筆者發(fā)現(xiàn)續(xù)斷中OB前3位的有效成分Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid均可以與關(guān)鍵調(diào)控基因結(jié)合，且最低生物結(jié)合能均小于0，表明結(jié)合穩(wěn)定，無(wú)需催化劑參與反應(yīng)，且大部分結(jié)合為3個(gè)氫鍵，結(jié)合牢固。

本研究在國(guó)內(nèi)外首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)分析續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制，提出其中關(guān)鍵基因靶點(diǎn)以及調(diào)控的可能機(jī)制。不足之處為采用在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，需要進(jìn)一步采用實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。而且數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)更新，續(xù)斷有效成分的作用靶點(diǎn)可能會(huì)存在變化。

續(xù)斷是促進(jìn)骨折愈合的傳統(tǒng)中藥，其有效成分有Gentisin、Sylvestroside Ⅲ_qt、(E，E)-3，5-Di-O-caffeoylquinic acid等，促進(jìn)骨折修復(fù)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)為PTGS2、HSP90AA1、MAPK14，且有效成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)均可以穩(wěn)定結(jié)合。