糖皮質(zhì)激素受體在缺血再灌注腎損傷中的作用

王向東 姜 敏 王 鑫 鞏永鳳*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東煙臺(tái) 264000；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東煙臺(tái) 264000；3.青島大學(xué)病理生理學(xué)教研室，山東青島 266000)

腎損傷是一個(gè)全球性疾病，具有高發(fā)病率、高病死率和低治愈率的特點(diǎn)，多由缺血再灌注、腎毒性藥物的使用和膿毒敗血癥等病因?qū)е耓1-2]。其中，缺血再灌注是腎損傷的主要誘因，主要有腎功能下降，血清中含氮廢物排出減少等臨床表現(xiàn)。腎小管的損傷與修復(fù)是腎功能損傷程度的主要標(biāo)志[1]，當(dāng)損傷因素過(guò)強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)不能及時(shí)被終止時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致腎功能的進(jìn)一步損傷并促使之后一系列不可逆過(guò)程的發(fā)生，沿著急性腎損傷→慢性腎功能衰竭→終末期腎病→尿毒癥這一過(guò)程進(jìn)展[3-5]。因此，探究腎損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制并找到有效延緩腎損傷發(fā)展的治療方法，對(duì)目前臨床治療腎損傷從而提高腎損傷患者生活質(zhì)量尤為重要。

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)誘導(dǎo)腎損傷的具體致病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前已有研究[6-8]報(bào)道與之有關(guān)的有炎癥反應(yīng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷等原因，其中炎性反應(yīng)在腎損傷的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用，腎損傷和炎性反應(yīng)相關(guān)通路有關(guān)。

糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)作為一個(gè)主要靶點(diǎn)，在炎性反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。GR分布于全身各個(gè)組織和細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，大部分存在于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，和熱休克蛋白結(jié)合以維持其正常構(gòu)象；當(dāng)受到某些激活因子刺激后，GR和熱休克蛋白分離并發(fā)生轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄特性，減弱相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的活性[9-10]。探究GR在IR誘導(dǎo)的腎損傷中的作用，不僅可以探究炎性反應(yīng)在IR誘導(dǎo)的腎損傷中的作用方式，同時(shí)也有助于發(fā)現(xiàn)在腎損傷中更多與GR相關(guān)聯(lián)的分子，從而對(duì)腎損傷進(jìn)一步深入的了解。

本研究通過(guò)構(gòu)建IR誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型，觀察腎小管在該過(guò)程中的損傷與修復(fù)；通過(guò)注射米非司酮(mifepristone, MF)阻斷GR入核，進(jìn)一步加重腎損傷和炎性反應(yīng)，深入探究了GR在腎損傷中的作用，為進(jìn)一步探究GR在腎損傷中的作用提供合適的模型和方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量約20～22 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0003。自由飲水?dāng)z食，12 h光照周期。倫理審批號(hào)：2021-172。

1.2 試劑

Trizol(美國(guó)Ambion公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；米非司酮(美國(guó)MCE生物科技公司)；RIPA裂解液、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑盒(南京建成科技有限公司)；DAPI(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒(日本Takara公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；腎損傷分子-(kidney injury molecular-1，Kim-1)抗體、GR抗體、巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司)；近端小管標(biāo)志物L(fēng)otus Tetragonolobus Lectin(LTL)(美國(guó)Vector Laboratories公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

小鼠數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組10只，用來(lái)驗(yàn)證模型構(gòu)建成功以及 GR 在缺血再灌注過(guò)程中的變化，分別為空白對(duì)照組，缺血再灌注后4、14、30和79 d組。

另外再取20只小鼠，數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，每組10只分別作為MF組和對(duì)照組，用來(lái)驗(yàn)證MF對(duì)腎損傷的影響，將MF溶解于DMSO中，使用時(shí)用玉米油稀釋?zhuān)谌毖俟嘧⒌那耙惶?，MF組小鼠腹腔注射含有MF的溶劑，對(duì)照組注射等劑量但不含藥物的相同溶劑，以排除DMSO和玉米油對(duì)腎臟的影響。

1.4 IR模型構(gòu)建

小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，腹腔注射20 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，待完全麻醉后備皮，置于38 ℃金屬水浴鍋上10 min以恢復(fù)體溫。膠帶固定四肢，碘伏消毒，剪開(kāi)左側(cè)皮膚，暴露單側(cè)腎臟以及腎蒂，使用微血管夾，夾閉動(dòng)靜脈45 min后，取下微血管夾，恢復(fù)腎臟血液供應(yīng)，縫合皮膚。缺血再灌注后4、14、30、79 d組分別于處理前一天麻醉后切除對(duì)側(cè)腎臟，次日摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腎臟。

1.5 腎組織取材

每組取6只小鼠的腎臟使用Trizol勻漿，提取RNA，進(jìn)行RT-qPCR。取2只小鼠的腎臟沿縱軸切開(kāi)，一半使用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定，常規(guī)脫蠟、浸石蠟包埋切片進(jìn)行過(guò)碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining，PAS)、蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)。一半OCT包埋，置于-80 ℃冰箱，用于免疫熒光染色；其余小鼠腎臟取出后置于液氮速凍，置于-80 ℃冰箱，用于蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western-blotting，WB)檢測(cè)。

1.6 血清的制備及保存

血液室溫靜置2 h后，4 ℃，3 000g離心15 min。收取上清，-80 ℃凍存。

1.7 腎組織RNA提取

去除腎臟被膜，置于1.5 mL Trizol內(nèi)，勻漿30 s。取1 mL勻漿后的液體置于1.5 mL EP管內(nèi)，室溫靜置10 min，加入氯仿200 μL/mL，用力震蕩15次充分混勻，室溫靜置3～5 min，4 ℃，12 000g離心15 min。溶液分3層，分2次取出上層400 μL水相置于新的1.5 mL EP管內(nèi)，加入預(yù)冷的異丙醇500 μL，翻轉(zhuǎn)4～5次混勻，室溫靜置10 min。4 ℃，12 000g離心10 min。棄上清，1 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗2遍，4 ℃，7 500g離心5 min，加入DEPC水置于金屬水浴鍋內(nèi)55 ℃孵育10 min溶解RNA，置于-80 ℃冰箱，用于RT-qPCR。

1.8 RT-qPCR

按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，最終結(jié)果使用循環(huán)閾值(CT值)減去β-actin的CT值，計(jì)算目的基因的2-△△Ct值，比較目的基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 mRNA引物序列(小鼠)

1.9 腎組織免疫熒光染色

將OCT包埋的腎組織使用冷凍切片機(jī)切成8 μm厚度，甲醇-20 ℃固定20 min，使用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))Tween 20的PBS封閉液封閉90 min，一抗為兔抗GR單克隆抗體(1∶200)和鼠抗F4/80單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，封閉液洗3次，二抗兔抗羅丹明和鼠抗FITC、腎臟近端小管染料LTL(1∶400)，室溫孵育2 h，封閉液洗3遍，DAPI室溫避光染核5 min，封閉液洗3遍，封片。使用880激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM880，德國(guó)蔡司)觀察拍照。

1.10 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

從-80 ℃取出腎臟，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿后用2 mL注射器抽吸50次以充分裂解組織，置于4 ℃翻轉(zhuǎn)混勻30 min，4 ℃，12 000g離心15 min，取上清，BCA法測(cè)濃度后調(diào)整上樣量。按照實(shí)驗(yàn)分組加入蛋白樣品，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tris-HCL SDS聚丙烯酰胺凝膠分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，然后使用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗(抗GR、抗β-actin抗體，1∶1 000)過(guò)夜。次日TBST清洗3次后，避光孵育二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，1∶2 000)室溫1 h，使用ECL發(fā)光液孵育2 min后顯影。

1.11 腎組織PAS和HE染色

取出4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定的腎臟，按照常規(guī)組織脫水浸蠟切片步驟[11]，進(jìn)行組織學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和損傷情況。

1.12 MF干預(yù)

MF是GR阻斷劑。先用DMSO將MF粉末配溶解成100 mg/mL的原液，使用時(shí)再用玉米油稀釋成10倍工作液，實(shí)驗(yàn)組于缺血再灌注手術(shù)前一天開(kāi)始第一次腹腔注射，每次注射劑量為50 mg/kg，每天注射1次，連續(xù)注射15 d，以阻斷GR入核[12-13]；對(duì)照組注射等劑量玉米油和DMSO 混合溶劑。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注對(duì)小鼠腎功能影響

腎臟缺血再灌注構(gòu)建過(guò)程(圖1A)。通過(guò)BUN和Scr試劑盒檢測(cè)小鼠腎功能發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，腎臟缺血再灌注組小鼠各觀察時(shí)間點(diǎn)的BUN和Scr均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BUN：F=200.6，P<0.01，每組值分別為：空白組：(16.06±1.05)mg/dL，單側(cè)缺血再灌注(unilateral ischemia-reperfusion, UIR)(day 4)+單側(cè)腎切除(unilater nephrectomy, UNX)(day 1):(78.43±3.51)mg/dL，UIR(day 14)+UNX(day 1):(29.24±2.92)mg/dL，UIR(day 30):(23.94±5.07)mg/dL，UIR(day 79)+UNX(day 1):(19.81±5.83)mg/dL。Scr：F=63.43，P<0.01，每組值分別為：空白組：(0.20±0.07)mg/dL，UIR(day 4)+UNX(day 1)：(1.67±0.32)mg/dL，UIR(day 14)+UNX(day 1):(1.12±0.07)mg/dL，UIR(day 30)+UNX(day 1):(0.34±0.06)mg/dL，UIR(day 79)+UNX(day 1):(0.35±0.07)mg/dL；n=6。再灌注后第4天組BUN和Scr濃度最高，隨后逐漸降低(圖1B)。PAS染色顯示，模型組相比空白組小管結(jié)構(gòu)紊亂，腎間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞增多(圖1C)。免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測(cè)顯示，和空白組相比，缺血再灌注第14天近端小管標(biāo)志物L(fēng)TL信號(hào)降低，Kim-1陽(yáng)性信號(hào)明顯增多，隨后逐漸減弱(圖1D)。

圖1 缺血再灌注對(duì)小鼠腎功能的影響

2.2 GR和腎臟炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

腎組織HE染色顯示，缺血再灌注后腎間質(zhì)會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞聚集(圖2A)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80、T細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3以及中性粒細(xì)胞表面標(biāo)志物L(fēng)y6G均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F4/80:F=11.31，P<0.01；CD3:F=15.9，P<0.05；Ly6G：F=4.469，P<0.05，n=6)，詳見(jiàn)圖2B。IF檢測(cè)顯示，與空白組相比，模型組F4/80陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng)，CD3陽(yáng)性信號(hào)輕度增強(qiáng)，同時(shí)，GR的表達(dá)和炎性反應(yīng)存在一個(gè)負(fù)相關(guān)性，詳見(jiàn)圖2C。

圖2 腎臟炎癥反應(yīng)和GR的關(guān)系

2.3 GR在IR誘導(dǎo)腎損傷過(guò)程中的變化

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GR的mRNA在IR誘導(dǎo)腎損傷后明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.84，P<0.001，n=6)，急性期顯著下降，但隨觀察時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)(圖3A)。免疫熒光結(jié)果(圖3B)和蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GR的蛋白質(zhì)水平也呈現(xiàn)先降低后逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)(圖3C)。

圖3 GR在缺血再灌注過(guò)程中的變化

2.4 GR阻斷后會(huì)加重IR誘導(dǎo)的腎損傷

腹腔注射MF后，實(shí)驗(yàn)組腎功能指標(biāo)Scr和BUN均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[BUN：50.82±3.91)mg/dLvs(60.45±3.20)mg/dL，P<0.01；Scr：(1.05±0.23)mg/dLvs1.71±0.08，P<0.01，n=6)]，說(shuō)明腎功能損傷加重(圖4A)。IF檢測(cè)結(jié)果顯示，使用米非司酮后F4/80和Kim-1陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明炎性反應(yīng)增強(qiáng)，腎損傷加重(4B，4C)。

圖4 GR阻斷對(duì)IR誘導(dǎo)腎損傷的影響

3 討論

炎性反應(yīng)參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)組織遭受應(yīng)激性刺激時(shí)，受損細(xì)胞會(huì)釋放大量促炎因子，募集炎癥細(xì)胞引起炎性反應(yīng)從而減輕損傷。隨著損傷的消除，抑炎因子釋放，炎性反應(yīng)逐漸消退，開(kāi)始進(jìn)入組織修復(fù)過(guò)程。然而，過(guò)度和未被及時(shí)終止的炎癥會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂、組織損傷和纖維化的發(fā)生[14]。正常情況下，多種炎癥細(xì)胞參與了機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持和受損組織的重建，尤其是巨噬細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)組織對(duì)損傷或應(yīng)激因素的反應(yīng)[15-17]。本實(shí)驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了近端小管的損傷與修復(fù)，包括腎損傷分子Kim-1的表達(dá)變化以及巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞3種炎性細(xì)胞在腎損傷發(fā)展過(guò)程中浸潤(rùn)數(shù)量的變化。

腎小管是對(duì)IR和腎毒性藥物損傷最敏感的部位，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡，炎性反應(yīng)的啟動(dòng)和纖維化的發(fā)生，如果損傷過(guò)強(qiáng)或者反復(fù)多次損傷，會(huì)導(dǎo)致腎臟的不適應(yīng)性修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致腎纖維化和慢性腎衰竭[18-19]。本研究結(jié)果表明，IR會(huì)導(dǎo)致腎臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，誘發(fā)大量的巨噬細(xì)胞，CD3+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并且不同類(lèi)型炎癥細(xì)胞出現(xiàn)和消退的時(shí)間存在差異。腎損傷的免疫炎癥由天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)共同參與，二者在組織損傷和修復(fù)中均具有雙刃劍效應(yīng)，其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)未闡明。比如，在疾病的不同階段，不同的炎癥細(xì)胞卻起到了相反的效應(yīng)，即便同樣是巨噬細(xì)胞，不同分型的巨噬細(xì)胞對(duì)于腎臟的損傷和修復(fù)也起到了截然相反的效應(yīng)。因此，探究炎性反應(yīng)在腎損傷過(guò)程中的作用并且恰當(dāng)?shù)乩醚装Y反應(yīng)治療和控制腎損傷的發(fā)生發(fā)展尤為重要[20-22]。

GR作為機(jī)體炎性反應(yīng)的重要靶點(diǎn)，存在于機(jī)體各種細(xì)胞，大部分位于細(xì)胞內(nèi)，極少部分位于細(xì)胞膜上，在正常生理狀態(tài)下，GR和熱休克蛋白結(jié)合位于胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)機(jī)體受到損傷而發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，糖皮質(zhì)激素釋放增多，糖皮質(zhì)激素便會(huì)和GR結(jié)合，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合在GRE區(qū)域，進(jìn)而誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)，發(fā)揮其抗炎的作用。此外，GR還可以和一些核分子結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，比如核因子-κB和激活蛋白-1，減弱其促炎作用而發(fā)揮抗炎效應(yīng)[23-25]。MF，俗稱(chēng)RU486是孕激素和糖皮質(zhì)激素的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，可以阻斷糖皮質(zhì)激素和GR以發(fā)揮其作用，注射MF阻斷GR時(shí)，會(huì)導(dǎo)致炎性反應(yīng)增強(qiáng)和器官損傷。有研究[26]顯示，燒傷小鼠注射MF會(huì)逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素的修復(fù)作用，使血管修復(fù)受阻，血管壁通透性增加，導(dǎo)致肺和腎功能?chē)?yán)重受損，進(jìn)而誘發(fā)多器官功能衰竭。此外，給脂多糖誘導(dǎo)的膿毒敗血癥小鼠注射MF后，發(fā)現(xiàn)MF抑制早期膿毒癥中p38的激活，以及晚期膿毒癥中p42/44 MAPK的激活[27]。然而，GR在IR誘導(dǎo)的腎損傷中的變化及作用尚未被深入探究。本研究表明，GR在IR誘導(dǎo)的腎損傷發(fā)生過(guò)程中存在時(shí)間依賴性，說(shuō)明GR在該過(guò)程中起到了重要的作用。因此，探究GR在腎損傷過(guò)程中的作用，有望為臨床治療腎損傷提供一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)[9，28]。

MF作為孕激素和糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑被大量研究，同時(shí)也已經(jīng)作為避孕藥在臨床推廣應(yīng)用，截至目前，未發(fā)現(xiàn) MF 在正常生理狀態(tài)下對(duì)腎功能存在毒副作用[29-30]，已有研究[31]表明在肝腎功能正常的情況下，使用MF對(duì)肝腎功能沒(méi)有影響。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，在IR誘導(dǎo)的腎損傷中，腹腔注射MF阻斷GR入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)率相比對(duì)照組明顯下降，腎損傷進(jìn)一步加重。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，腹腔注射MF會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致IR誘導(dǎo)腎損傷后腎組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)增多，加重腎臟損傷，說(shuō)明腎臟中的GR可能通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而保護(hù)腎臟免受IR誘導(dǎo)的損傷。

本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GR和IR誘導(dǎo)腎損傷有明顯的相關(guān)性并且起到了重要的作用，但作用的具體機(jī)制以及與炎癥因子互作而調(diào)控炎性反應(yīng)強(qiáng)度尚未闡明。接下來(lái)可以通過(guò)構(gòu)建和GR相關(guān)分子的基因敲除小鼠，在IR誘導(dǎo)腎損傷模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證和探究。本次通過(guò)在IR誘導(dǎo)的腎損傷小鼠模型上，注射MF阻斷GR，證實(shí)了GR阻斷后會(huì)進(jìn)一步加重IR誘導(dǎo)的腎損傷，為今后深入探究GR在腎損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)思路和實(shí)驗(yàn)方法。