M2巨噬細(xì)胞對新生乳鼠受損心臟組織的再生和修復(fù)機(jī)制

王 茜 張家坤 劉 青 孫 琳 李晶潔*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸痛中心，哈爾濱 150001；2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，天津 301800；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科二病房，哈爾濱 150001)

心臟受損后心肌組織的再生和修復(fù)效率低下是造成大部分心臟疾病的原因之一，嚴(yán)重者短時(shí)間內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)心力衰竭，而心力衰竭正是世界范圍內(nèi)造成人類死亡的一個(gè)主要原因[1]。在新生哺乳動(dòng)物[2-10]，如乳鼠[4-8]和豬[9-10]中，在出生后7 d內(nèi)心臟保留了將損傷心肌組織完全修復(fù)的能力，但成年哺乳動(dòng)物中心臟的這種再生修復(fù)能力完全喪失。Porrello等[5]在2011年發(fā)現(xiàn)新生乳鼠心臟切除10%的心尖后依然具有完全再生的能力，且最近國內(nèi)外多項(xiàng)研究[11-12]證實(shí)7 d內(nèi)新生乳鼠的心臟具有再生能力，可以將其作為哺乳動(dòng)物心臟再生的研究模型。在新生心肌損傷后的修復(fù)過程中免疫反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用[13-21]，其中巨噬細(xì)胞的作用更是無可替代，盡管其潛在機(jī)制尚不完全清楚[22]。

巨噬細(xì)胞作為一種可塑性強(qiáng)的細(xì)胞群[23-25]，參與了多個(gè)器官(如腸道、肺和皮膚等)的炎性反應(yīng)和傷口愈合，可對心肌損傷后的環(huán)境信號(hào)作出相應(yīng)反應(yīng)，極化為兩個(gè)功能不同的亞群，即經(jīng)典活化型(M1)巨噬細(xì)胞和交替活化型(M2)巨噬細(xì)胞。心肌梗死(myocardial infarction，MI)后，M1和M2巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)在受損的心肌組織中。早期炎性反應(yīng)階段，M1巨噬細(xì)胞通過分泌大量促炎因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6等浸潤心肌損傷區(qū)[16，18，26-27]，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促炎性反應(yīng)表型。M1和中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等降解并清除壞死的碎片和凋亡細(xì)胞，這是組織修復(fù)的必要準(zhǔn)備。然而，如果促炎反應(yīng)變得過度或不受控制，它將導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)并抑制愈合過程。而M2巨噬細(xì)胞具有完全相反的功能，它可以抑制炎性反應(yīng)和修復(fù)受損組織。M2巨噬細(xì)胞激活成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致纖維化瘢痕形成，增強(qiáng)脆弱的心室壁[28-30]。因此，隨著M1巨噬細(xì)胞增加的減少，心臟中M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加，在MI[6-10，31]后第5～7天達(dá)到峰值。這種細(xì)胞還能在受損的心肌組織中誘導(dǎo)血管和交感神經(jīng)生成。

M2巨噬細(xì)胞也參與誘導(dǎo)缺血組織中的新生血管形成。近年來多項(xiàng)研究[32-33]證實(shí)乳鼠心臟再生與神經(jīng)、血管的形成以及細(xì)胞外基質(zhì)等有關(guān)。通過RNA修飾技術(shù)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，可以增強(qiáng)鼠心肌梗死后心臟再生能力，提示血管生成在心臟再生時(shí)發(fā)揮重要作用。White等[33]及Mahmoud等[34]通過手術(shù)切除迷走神經(jīng)或者用6-羥基多巴胺氫溴酸鹽(6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA)化學(xué)消融交感神經(jīng)證實(shí)抑制交感神經(jīng)再生可以削弱心臟損傷后再生的能力，而靶器官中神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的表達(dá)程度決定了交感神經(jīng)的支配密度[19]。這些研究[33-34]表明神經(jīng)可能通過NGF參與心臟再生，但M2巨噬細(xì)胞能否通過影響神經(jīng)及血管的新生促進(jìn)心臟再生目前尚不清楚。因此，本研究應(yīng)用乳鼠心尖切除模型研究巨噬細(xì)胞極化在哺乳動(dòng)物心臟再生中的作用及部分機(jī)制，旨在揭示心臟再生時(shí)不同巨噬細(xì)胞的功能及其對血管和神經(jīng)再生的影響，并進(jìn)一步探究M2巨噬細(xì)胞在神經(jīng)及血管再生方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康6～8周齡SD雄性大鼠以及同系源出生后第1天(P1)和第7天(P7)新生SD乳鼠，取自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黑)2019-001]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均按照機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理指南進(jìn)行，并經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)倫理審批，倫理審批號(hào)：2020044。動(dòng)物被飼養(yǎng)在一個(gè)特定的無病原體動(dòng)物設(shè)施中，在12 h的光-暗循環(huán)中自由獲得食物和水。

1.2 試劑與抗體

ACK紅細(xì)胞裂解液購自Solarbio公司(中國)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、TNF-α抗體及IL-4抗體購自Peprotech公司(美國)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)溶液、胰蛋白酶-EDTA購自Every Green公司(美國)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)抗體購自Sigma公司(日本)；RNA提取試劑盒購自Axygen公司(美國)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司(瑞士)；酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體、CD34抗體、NGF抗體、TH抗體、CD34抗體購自Boster公司(中國)，VEGF抗體購自Bioss公司(中國)，IgG-HRP二抗購自Zsbio公司(中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨髓源性巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和極化

原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)嚴(yán)格按照無菌程序進(jìn)行，避免污染。采用頸椎脫位法處死6～8周齡健康雄性大鼠，固定于手術(shù)板上，收集股骨和脛骨放入75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇消毒。割斷長骨的末端，用1×PBS沖洗掉骨髓。用ACK 紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)在4 ℃下離心30 min分離單核細(xì)胞，洗滌，重懸于含有10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活的FBS，50 U/mL青霉素和50 mg/mL鏈霉素，10 ng/mL GM-CSF的DMEM溶液中，接種于培養(yǎng)皿中，密度為每10 cm培養(yǎng)皿中(每只乳鼠)培養(yǎng)細(xì)胞27×106個(gè)，并在37 ℃下在含有5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的環(huán)境中培養(yǎng)過夜。第2天，將未貼壁或貼壁較弱的細(xì)胞回收，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中并在上述相同條件下培養(yǎng)，貼壁的細(xì)胞被丟棄。每天監(jiān)測培養(yǎng)情況，并定期補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后，用PBS輕輕沖洗黏附的骨髓來源的巨噬細(xì)胞，并短暫暴露于胰蛋白酶-EDTA中獲得巨噬細(xì)胞。LPS和TNF-α溶液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞極化至M1巨噬細(xì)胞，IL-4 溶液誘導(dǎo)24 h極化為M2巨噬細(xì)胞。

1.3.2 新生乳鼠建立心尖切除模型

取出生后第1天(P1)的新生乳鼠行心尖切除術(shù)，術(shù)后采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組:對照組(僅手術(shù)組)、M1巨噬細(xì)胞植入組和M2巨噬細(xì)胞植入組。每一組至少有20只新生乳鼠。采用新生的P7乳鼠重復(fù)了所有的實(shí)驗(yàn)。

為了檢測極化巨噬細(xì)胞對心肌再生和修復(fù)的影響，首先通過手術(shù)切除P1和P7新生乳鼠的左心室尖(約10%的心室心肌)建立心尖切除模型。切除體積。心尖切除手術(shù)模型成功的標(biāo)志為心室腔暴露，心尖切口處流血，有血細(xì)胞聚集、血凝塊形成，堵塞破損的心尖部缺口防止心室腔內(nèi)的血液繼續(xù)外流。

將P1或P7新生乳鼠置于冰床上進(jìn)行低溫麻醉，后固定于手術(shù)操作臺(tái)上使乳鼠保持右側(cè)臥位，在第四或第五肋間隙平行于肋間隙切開胸腔，鈍性分離皮下組織及肌肉入胸，用顯微手術(shù)剪剪除提起的心尖部肌肉組織，手術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)為暴露出左心室腔，切除約10%心室心肌。切除結(jié)束時(shí)，將0.05 mL M1巨噬細(xì)胞局部注射到心尖切除部位作為M1巨噬細(xì)胞植入組，將0.05 mL M2巨噬細(xì)胞局部注射到心尖切除部位作為M2巨噬細(xì)胞植入組(圖1)，行心尖切除術(shù)但未植入巨噬細(xì)胞的作為對照組。手術(shù)后，縫合切口，并對新生乳鼠進(jìn)行復(fù)溫，使其完全恢復(fù)生命體征平穩(wěn)。術(shù)后7 d，收集各組心臟組織進(jìn)行組織學(xué)和分子分析。

圖1 新生乳鼠左心尖手術(shù)切除示意圖

1.3.3 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

使用RNA提取試劑盒從巨噬細(xì)胞或心肌組織中提取總RNA。用分光光度計(jì)測定RNA樣品的數(shù)量和純度。cDNA由羅氏第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)在梯度PCR儀器(賽默飛世爾科技公司，美國)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。每個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)水平與管家基因β-actin或GAPDH的mRNA水平進(jìn)行對照。

引物序列如下：CD163，正向: 5′-GGATTGCCCTATGACTGCTCT-3′，反向: 5′-TTGGACCGAAGATGATGAACTAC-3′;CD86，正向: 5′-GCTCGTAGTATTTTGGCAGGAC C-3′，反向: 5′-CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC-3′;β-actin，正向: 5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，反向: 5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′;IL-6，正向: 5′-AGAAGACCAGAGCAGATTTT-3′，反向: 5′-GAGAAAAGA GTTGTGCAATG-3′;IL-1β，正向: 5′-GGGATGATGACGA CCTGC-3′，反向: 5′-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3′;趨化因子配體-3[chemokine(C-C motif)ligand-3,CCL-3]，正向: 5′-CATGGCGCTCTGGAACGAA-3′，反向: 5′-TG CCGTCCATAGGAGAAGCA-3′;VEGF，正向: 5′-AGAAAG CCCATGAAGTGGTGA-3′，反向: 5′-CTTCATCATTGCAGCAGCCC-3′;NGF，正向: 5′-TCGCTCACTCCACTATCCA CTA-3′，反向: 5′-GACTCAACAGGGCAAGCATAC-3′; GA PDH，正向: 5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，反向:5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′。

1.3.4 HE染色

將新生乳鼠心臟組織固定在10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛溶液中，用不同濃度乙醇(75%、85%、95%，無水)脫水，石蠟包埋，切成5 μm切片，置于載玻片上。隨后常規(guī)脫蠟，蘇木精-伊紅染色。玻片脫水后密封，室溫保存。在顯微鏡下觀察并記錄組織學(xué)形態(tài)。

1.3.5 免疫組織化學(xué)

乳鼠心臟組織在10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛和石蠟包埋中固定至少24 h。垂直于心外膜切開4 μm的透壁切片，安裝在帶電載玻片上，按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行染色。簡言之，將石蠟切片脫蠟并再水化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序回收抗原。切片在4 ℃孵育過夜，一抗如下：TH抗體(1∶100)，CD34抗體(1∶100)，VEGF抗體(1∶400)，NGF抗體(NGF，1∶10)。24 h后，沖洗玻片，室溫下用IgG-HRP二抗孵育15 min。采用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(Imagepro Plus 6.0軟件)測定血管、神經(jīng)、VEGF、NGF密度，計(jì)算積分吸光度(integral optical dens，A)平均值。

1.3.6 免疫熒光染色

心臟組織用液氮冷凍，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定，切成10 μm厚的冷凍切片。切片在室溫封閉液中孵育1 h，然后用TH抗體(1∶10)或CD34抗體(1∶10)在4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，室溫下用含0.5%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100的PBS溶液稀釋TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)孵育。1 h后，PBS沖洗3次，DAPI孵育10 min，干燥后蓋上蓋玻片進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(Imagepro Plus 6.0)測量熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 M1和M2巨噬細(xì)胞的極化和特征

用GM-CSF分離培養(yǎng)大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)7 d。培養(yǎng)后1 d，大部分細(xì)胞黏附在培養(yǎng)板上，外觀呈紡錘形、長梭形和多邊形形態(tài)。培養(yǎng)7 d，細(xì)胞增生良好，保持梭形形態(tài)，細(xì)胞群呈放射狀排列的同心圓狀生長，這是巨噬細(xì)胞的典型生長特征。培養(yǎng)7 d后，分別加入LPS + TNF-α和IL-4，使細(xì)胞極化至M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞。LPS + TNF-α刺激24 h后，細(xì)胞呈長梭形，偽足細(xì)長，與M1巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征一致。IL-4刺激后，細(xì)胞變大變圓，偽足變短，呈現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞的特征(圖2)。

圖2 M1和M2巨噬細(xì)胞體外極化結(jié)果

采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測極化后的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，其中M1巨噬細(xì)胞為CD86，M2巨噬細(xì)胞為CD163。與形態(tài)變化一致的是，IL-4極化后的細(xì)胞顯示出M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163的升高；而M1巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD68在IL-4的刺激下沒有變化。LPS+TNF-α處理顯著刺激了極化細(xì)胞中CD68的表達(dá)，而不是CD163的表達(dá)(圖2B)。

2.2 M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)心臟損傷后心肌再生和修復(fù)

術(shù)后7 d，一系列的組織學(xué)分析顯示，血凝塊首先出現(xiàn)在切除部位，并逐漸被吸收，切除區(qū)域心肌組織充盈。新生心肌細(xì)胞在P1乳鼠中的排列比在P7新生兒中的排列更有序。在P1乳鼠受損心肌組織中也觀察到較少的炎性反應(yīng)細(xì)胞(圖3A)。

術(shù)后7 d心尖切除部位再生心肌組織中，M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68 在M1巨噬細(xì)胞植入組檢測到的表達(dá)水平明顯高于對照組和M2巨噬細(xì)胞植入組；M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163在M2巨噬細(xì)胞植入乳鼠中顯著增加，而在其他兩組乳鼠中幾乎不增加(圖2C和2D)。

術(shù)后7 d HE染色結(jié)果顯示，在P1和P7乳鼠中，M2巨噬細(xì)胞的植入顯著改善了心肌的再生和修復(fù)(圖3A)。與對照組相比，M2巨噬細(xì)胞的植入能顯著促進(jìn)受損心肌組織的再生和修復(fù)，心肌細(xì)胞組織有序，免疫細(xì)胞浸潤較少，纖維化程度下降。而M1巨噬細(xì)胞植入組乳鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，大量吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤彌散分布，間質(zhì)中含鐵血黃素淤積。P1和P7乳鼠組織再生區(qū)心肌細(xì)胞含量按照M1植入組、對照組和M2植入組的順序而增加；M1巨噬細(xì)胞植入組乳鼠的炎性細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)相反的順序：M1巨噬細(xì)胞植入組>對照組>M2巨噬細(xì)胞植入組(圖3A)。

2.3 M2巨噬細(xì)胞可抑制心肌組織損傷引起的炎性反應(yīng)

與對照組相比，M1巨噬細(xì)胞植入組乳鼠的3種主要炎性反應(yīng)因子IL-6、IL-1β和CCL-3濃度顯著升高。然而，M2巨噬細(xì)胞植入通過降低IL-6、IL-1β和CCL-3濃度來拮抗炎性反應(yīng)(圖3B)。

圖3 M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)受損心肌組織的再生和修復(fù)

2.4 巨噬細(xì)胞極化影響血管生成和交感神經(jīng)支配

P1和P7乳鼠術(shù)后7 d M2巨噬細(xì)胞植入組均顯著增加新生血管和交感神經(jīng)數(shù)量；M1巨噬細(xì)胞植入組乳鼠的組織再生區(qū)血管和神經(jīng)較對照組少。此外，在所有實(shí)驗(yàn)個(gè)體中，P1乳鼠在血管和交感神經(jīng)再生方面表現(xiàn)出比P7乳鼠更強(qiáng)的能力(圖4)。免疫組織學(xué)觀察結(jié)果表明，P1乳鼠組織再生區(qū)交感神經(jīng)A平均值分別為：對照組252.30±13.56、M1巨噬細(xì)胞植入組109.90±5.17、M2巨噬細(xì)胞植入組397±14.77，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組血管A平均值分別為：對照組166.7±3.93、M1巨噬細(xì)胞植入組93.37±2.52(P<0.05)、M2巨噬細(xì)胞植入組243.8±26，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P7乳鼠組織再生區(qū)交感神經(jīng)A平均值分別為：對照組145.4±3.52、M1巨噬細(xì)胞植入組56.03±8.20、M2巨噬細(xì)胞植入組216±13.07，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組血管A平均值分別為：對照組109.8±6.37、M1巨噬細(xì)胞植入組55.51±8.07、M2巨噬細(xì)胞植入組169.8±11.91，M1、M2兩組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 M1、M2巨噬細(xì)胞植入后7 d，P1和P7乳鼠再生心肌組織血管和交感神經(jīng)的變化

2.5 M2巨噬細(xì)胞通過釋放生長因子促進(jìn)交感神經(jīng)支配和血管再生

對P7乳鼠進(jìn)行心尖切除術(shù)，將等量的M2巨噬細(xì)胞植入受損心肌組織的損傷區(qū)(距切緣1 mm以內(nèi))和邊界區(qū)(距切緣1～2 mm)。術(shù)后7 d，分別測定心尖損傷區(qū)和邊界區(qū)交感神經(jīng)和血管的分布。在損傷區(qū)，M2巨噬細(xì)胞植入可顯著增加血管生成和交感神經(jīng)支配。對照組和M2巨噬細(xì)胞植入組乳鼠血管A平均值分別為188.3±12.41和139.7±5.78，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組和M2巨噬細(xì)胞植入組交感神經(jīng)A平均值分別為576.3±43.32和339.7±23.9，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在邊界區(qū)，M2巨噬細(xì)胞植入也觸發(fā)了新生血管生成和交感神經(jīng)支配，但強(qiáng)度較低。對照組和M2巨噬細(xì)胞植入組乳鼠邊界區(qū)血管A平均值分別為100±2.52和86.33±8.01，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 對照組和M2巨噬細(xì)胞交感神經(jīng)A平均值分別為113±5.51和85.67±6.19，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 觀察P7乳鼠切除部位及邊緣區(qū)M2巨噬細(xì)胞植入后血管及交感神經(jīng)的變化

組織中VEGF和NGF的濃度，與對照組相比，M2巨噬細(xì)胞的植入顯著提高了再生心肌組織中VEGF和NGF濃度，這兩種因子濃度的增加與植入巨噬細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)(圖6)。

圖6 M2巨噬細(xì)胞植入后再生心肌組織中VEGF和NGF變化

3 討論

在新生哺乳動(dòng)物(如乳鼠和豬)的心臟中，已經(jīng)觀察到心臟損傷后的有效和完整的再生[4-10]，盡管這種再生能力在出生后一段時(shí)間后迅速減弱。然而，在一定條件下，成年哺乳動(dòng)物心臟也可能保留心肌細(xì)胞更新的能力。例如，缺氧預(yù)處理的成年小鼠在心肌梗死后[35]有很強(qiáng)的再生反應(yīng)和更少的纖維化，再生心肌細(xì)胞來源于原始心肌細(xì)胞。到目前為止，尚不清楚新生哺乳動(dòng)物心臟為何具有再生潛能，因此，了解啟動(dòng)心肌再生的關(guān)鍵事件對于設(shè)計(jì)有效修復(fù)受損心肌組織從而恢復(fù)心功能的新方案至關(guān)重要。

巨噬細(xì)胞在心肌再生中起著關(guān)鍵作用，Aurora等[36]應(yīng)用巨噬細(xì)胞耗竭模型證實(shí)巨噬細(xì)胞耗盡的新生乳鼠在心肌損傷后無法再生心肌并形成纖維化瘢痕，心臟功能降低。與此觀察一致，本研究中M2巨噬細(xì)胞植入有利于心尖切除后心肌再生，心肌再生組織中心肌細(xì)胞增多，炎性反應(yīng)細(xì)胞減少，纖維化減少。然而，M1巨噬細(xì)胞通過更多的炎性反應(yīng)細(xì)胞、更少的心肌細(xì)胞和更強(qiáng)的纖維化抑制心臟再生。這些現(xiàn)象可能與兩種極化巨噬細(xì)胞的固有特性有關(guān)。M1巨噬細(xì)胞是通過分泌炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的促炎表型，而M2巨噬細(xì)胞具有抗炎功能。事實(shí)上，在本研究中，當(dāng)M1巨噬細(xì)胞植入心臟組織時(shí)，炎性反應(yīng)因子IL-1β、IL-6和CCL-3顯著升高；與對照組相比，M2巨噬細(xì)胞植入顯著降低了這些炎性反應(yīng)因子，可能導(dǎo)致更有效的心肌再生和修復(fù)。在成人心臟中，M1巨噬細(xì)胞數(shù)量在心肌梗死后第3天達(dá)到峰值，然后M2巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著M1巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少而增加，在心肌梗死后第5～7天[6-10，31]達(dá)到峰值。M2巨噬細(xì)胞激活成年損傷心臟的成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致纖維化瘢痕的形成，增強(qiáng)受損心臟的脆弱心室壁[28-30]。M2巨噬細(xì)胞有利于新生心臟心肌再生或觸發(fā)成年心臟瘢痕形成可能取決于不同的微環(huán)境線索，有待進(jìn)一步研究。

越來越多的證據(jù)[5，35]表明，心肌損傷后的再生和修復(fù)需要血管新生和交感神經(jīng)支配。新生哺乳動(dòng)物心臟損傷后，如心尖切除[5]、冰凍[35]、心肌梗死等，新生血管大量形成，心肌組織再生修復(fù)，心肌功能恢復(fù)。交感神經(jīng)支配對心肌再生和修復(fù)也是必不可少的，因?yàn)槿ソ桓猩窠?jīng)支配能夠完全抑制新生心臟[31]損傷后的心肌再生。本研究還證實(shí)了新生血管和交感神經(jīng)在P1和P7新生乳鼠心尖切除后的再生組織中的功能是強(qiáng)大的。此外，相比較M1巨噬細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞植入受損心肌組織后可顯著促進(jìn)新生血管生成和交感神經(jīng)支配，導(dǎo)致更強(qiáng)勁的心肌再生和修復(fù)。在心肌梗死成年乳鼠中誘導(dǎo)VEGF表達(dá)可以誘導(dǎo)血管生成，從而改善組織周轉(zhuǎn)和心功能恢復(fù)[37]。心臟和其他組織中的神經(jīng)生長因子是決定交感神經(jīng)系統(tǒng)[38]神經(jīng)支配密度的關(guān)鍵因素，在手術(shù)切除的犬心臟[39]中，神經(jīng)生長因子的增加可以增強(qiáng)交感神經(jīng)支配。在本研究中，M2巨噬細(xì)胞以劑量依賴性的方式顯著誘導(dǎo)損傷組織中VEGF和NGF的升高，這可能有助于M2巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的心肌再生。

本研究結(jié)果表明巨噬細(xì)胞極化可能通過調(diào)節(jié)新生血管和交感神經(jīng)支配影響新生乳鼠心肌的再生和修復(fù)。M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)心肌再生；M1巨噬細(xì)胞抑制心臟修復(fù)。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞M2/M1比例可能是心肌受損后心肌組織修復(fù)的新策略。