lncRNA FOXCUT和FOXC1在結(jié)直腸癌中的表達及其相關(guān)性

劉 永， 徐建忠， 蔣 敏， 倪玲娜， 凌 揚

(蘇州大學(xué)附屬常州腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇省常州市213032)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)高死亡疾病之一，其診斷多見于中晚期且轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險較高，其5年存活率不足55%[1]，故結(jié)直腸癌診斷指標及治療靶點成為目前研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，叉頭框C1(fork head boxC1，F(xiàn)OXC1)轉(zhuǎn)錄因子基因參與肝細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、乳腺癌多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且FOXC1表達水平與腫瘤的不良預(yù)后息息相關(guān)[2-3]。位于FOXC1基因啟動子上游的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)轉(zhuǎn)錄體，簡稱為FOXCUT，為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其與相鄰的FOXC1蛋白編碼基因相互作用，以一種“l(fā)ncRNA-mRNA”基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[4]。本研究重點探析lncRNA FOXCUT和FOXC1在結(jié)直腸癌中的表達及其相關(guān)性，為結(jié)直腸癌研究提供新的線索及靶點。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集本院2013年1月—2017年12月75例結(jié)直腸癌原發(fā)病灶組織標本及配對癌旁正常組織標本，術(shù)前未開展放射或化學(xué)治療，樣本新鮮取材置于-80 ℃環(huán)境凍存。本研究樣本使用均遵循倫理學(xué)規(guī)范，報醫(yī)院醫(yī)學(xué)理論委員會批準，患者知情同意，臨床資料齊全，病理學(xué)確診符合結(jié)直腸癌診斷標準[5]，均為腺癌(管狀腺癌68例，黏液腺癌7例)。

1.2 免疫組織化學(xué)法

樣本組織石蠟包埋，經(jīng)切片脫蠟水化；消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，3次PBS沖洗，采用EDTA(pH9.0)，微波抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，以在預(yù)實驗中已反復(fù)證實的FOXC1棕黃色顆粒顯色作陽性對照，Image Pro Plus圖像分析。

1.3 Western blot

取組織細胞總蛋白SDS-PAGE電泳，100 V冰浴轉(zhuǎn)膜50 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST緩沖液配制的封閉液中封閉，TBST洗滌，ECL曝光、定影，Quantity one軟件顯色分析。

1.4 Real Time PCR

Trizol法進行總RNA提取，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，F(xiàn)OXC1引物設(shè)計：Forward 5′-GGCGAGCAGAGCTACTACC-3′，Reverse 5′-TGCGAGTACACGCTCATGG-3′；FOXCUT引物設(shè)計：Forward 5′-GTCGCACCGATGACTAACG-3′，Reverse 5′-GCCCTGAAAGCCGAACTG-3′，PCR儀進行擴增熒光定量檢測，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)孵育60 s、95 ℃擴增10 s,45個循環(huán)，60 ℃ 30 s，65 ℃溶解曲線，基于β-actin內(nèi)參，以2-△△Ct法計算mRNA表達量。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染細胞后的RNAi實驗

選用X-Tregen介導(dǎo)siRNA的轉(zhuǎn)染，按照X-Tregen轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作siRNA轉(zhuǎn)染細胞，F(xiàn)OXC1 siRNA序列：Forward 5′-RCRCRARGRARURARARCRARCR GRURARARGRURURURCRURURCTT-3′，Reverse 5′-TGCGAGTACACGCTCATGG-3′；FOXCUT引物設(shè)計：Forward 5′-RARARGRARARGRARARARCRURURARCR GRURGRURURARURCRURGRGRARG-3′；FOXCUT siRNA序列：Forward 5′-RGRARARURGRGRARGRARA RCRURARARGRARCRARARURURARUCT-3′，Reverse 5′-RARGRARURARARURURGRURCRURURARGRU RURCRURCRCRARURURCRGRG-3′。37 ℃、5%CO2環(huán)境，10 mL DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，備制FOXCUT、FOXC1細胞懸液，SW480細胞傳代生長至對數(shù)期時PBS沖洗、消化、重懸細胞至5×104個/mL，接種于6孔板(20 μL/孔)，并在6孔板中加入3 mL DMEM底液，每組重復(fù)2孔。待細胞融合達70%，轉(zhuǎn)染24 h后取NC siRNA、FOXCUT siRNA、FOXC1 siRNA組SW480細胞，采用移液槍頭(1 mm直徑)進行劃痕觀察，并分別采集24 h與48 h圖像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組lncRNA FOXCUT表達水平的比較

lncRNA FOXCUT高表達率結(jié)直腸癌組織為82.67%(62/75)，癌旁正常組織為14.67%(11/75)，結(jié)直腸癌組織高于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2 lncRNA FOXCUT表達與結(jié)直腸癌患者病理特征的關(guān)系

lncRNA FOXCUT表達與結(jié)直腸癌患者TNM分期、AJCC分期、分化程度、遠端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征相關(guān)(P<0.05；表1)。

表1 lncRNA FOXCUT表達與結(jié)直腸癌患者病理特征的關(guān)系 單位：例(%)

2.3 兩組FOXC1、FOXCUT表達水平的比較

結(jié)直腸癌組織FOXC1蛋白表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05；圖1)。siRNA轉(zhuǎn)染細胞發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織FOXCUT siRNA和FOXC1 siRNA表達水平均明顯低于癌旁正常組織；結(jié)直腸癌組織FOXC1 mRNA、FOXCUT mRNA表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05；表2)。

圖1 兩組FOXC1蛋白表達水平的比較

表2 siRNA轉(zhuǎn)染檢測結(jié)直腸癌組織FOXC1、FOXCUT mRNA的表達水平(n=75)

2.4 FOXC1與FOXCUT mRNA表達相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析，結(jié)直腸癌組織FOXC1 mRNA表達與FOXCUT mRNA表達呈正相關(guān)(圖2)。

圖2 FOXC1 mRNA與FOXCUT mRNA表達的相關(guān)性

3 討 論

結(jié)直腸癌屬臨床常見消化道惡性腫瘤，且為消化道癌癥致死第二位[6]。近年來臨床對于結(jié)直腸癌的治療技術(shù)與策略不斷革新，但結(jié)直腸癌5年存活率并無明顯改善，依舊有30.5%～61.7%患者發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[7-8]。因此積極探尋結(jié)直腸癌診治的靶向分子標志物，研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制成為業(yè)界關(guān)注熱點。

有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1表達異常與惡性腫瘤發(fā)生及病情進展密切相關(guān)，如上調(diào)FOXC1表達可造成卵巢癌細胞增殖活性反應(yīng)，而FOXC1表達降低可預(yù)測前列腺癌侵襲進展及不良預(yù)后[9]。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織FOXC1表達高于癌旁正常組織，表明FOXC1參與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移發(fā)展。推測FOXC1通過上皮間質(zhì)化(EMT)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進腫瘤血管生成途徑等影響腫瘤細胞的生長和增殖而參與到各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，與馮晉等[10]研究一致。

近年對lncRNA的研究不斷深入，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著促癌及抑癌作用，參與了細胞凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及表觀遺傳學(xué)調(diào)控層面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。本研究結(jié)果中，結(jié)直腸癌組織lncRNA FOXCUT高表達率為82.67%，高于癌旁正常組織，且lncRNA FOXCUT高表達與患者TNM分期、AJCC分期、高分化等病理特征明顯相關(guān)(P<0.05)，提示lncRNA FOXCUT高表達的結(jié)直腸癌細胞具有較強的細胞增殖功能，同時遠端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，推測lncRNA FOXCUT高表達可促進癌細胞侵襲功能，增加遠端轉(zhuǎn)移風(fēng)險，表明lncRNA FOXCUT在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中有促癌基因的效應(yīng)。

lncRNA復(fù)雜多樣，但是其對基因的調(diào)控方式卻很相似，有規(guī)律可循，在表達或功能調(diào)節(jié)上，lncRNA之間及其與臨近的mRNA之間存在著某種關(guān)聯(lián)，很大比例的lncRNA與相鄰的mRNA基因相互作用[13]，“l(fā)ncRNA-mRNA”基因是調(diào)控疾病的表觀遺傳學(xué)中一種新的模式。本研究通過相關(guān)性分析可知，結(jié)直腸癌組織FOXC1 mRNA與FOXCUT mRNA表達呈正相關(guān)，推測FOXC1為FOXCUT靶基因，可基于“l(fā)ncRNA-mRNA”基因遺傳學(xué)相關(guān)原則促進結(jié)直腸癌腫瘤進展，能夠以FOXCUT-FOXC1基因模式調(diào)控腫瘤進程。

綜上所述，F(xiàn)OXC1與FOXCUT在結(jié)直腸癌細胞中呈高表達，且FOXC1 mRNA與FOXCUT mRNA表達呈正相關(guān)性，存在相互作用調(diào)控腫瘤細胞增殖及侵襲的作用。