蘇 靜, 許 芳, 胡 宏, 文菁菁
(綿陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科,四川省綿陽市621000)
淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)[1],HL和NHL的臨床表現(xiàn)和組織病理特征存在明顯的差異,雖然放射治療、化療、造血干細(xì)胞移植等取得明顯進(jìn)展,但由于淋巴瘤的高度異質(zhì)性,其預(yù)后往往不甚理想。因此,隨著靶向治療的發(fā)展,分子靶點(diǎn)和分子靶向藥物成為淋巴瘤治療的重要突破口[2]。腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2)主要表達(dá)于造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,具有抗炎、促進(jìn)骨折愈合,以及抗脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷的作用[3]。此外,TNFR2與腫瘤發(fā)生發(fā)展也有著密切的聯(lián)系,TNFR2可促進(jìn)卵巢癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]細(xì)胞遷移和侵襲,但其在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。本研究觀察了TNFR2對HL細(xì)胞系L428細(xì)胞增殖活性及阿霉素(adriamycin amycin,ADM)耐藥的影響,現(xiàn)報道如下。
PcDNA3.1/TNFR2載體質(zhì)粒(大連寶生物工程公司);DDK-1(北京諾博萊科技有限公司);沙利度胺購于常州制藥廠,為純品原料藥, 溶于二甲基亞砜(DMSO) 后得50 g/L的母液,處理L428為300 mg/L沙利度胺;ADM(浙江海正藥業(yè)股份有限公司, H33021980)。RIPA裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)箱、Trizol、PrimeScript qRT-PCR試劑盒(賽默飛世爾);Kit試劑盒、BCA試劑盒、CCK-8試劑盒(武漢艾迪抗生物科技有限公司);LY294002、TNFR2、磷酸化蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphorylated protein serine threonine kinase,p-Akt)、Akt、β-4-4catenin和GAPDH一抗(Sigma公司);ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀(迪圖上海生物科技有限公司);FT-SY96S酶標(biāo)儀、垂直電泳儀(美國Bio-RAD公司)。
L428細(xì)胞購自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司,采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37 ℃、5%CO2、97%濕度培養(yǎng)基中培養(yǎng),每2~3天換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞分為6組:轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的對照組、轉(zhuǎn)染PcDNA3.1/TNFR2的上調(diào)組(upregulation group,UR組)、上調(diào)TNFR2并抑制Akt組(LY294002組,LY組)及上調(diào)TNFR2并抑制WNT通路組(DKK1組,DK組)、L428細(xì)胞過表達(dá)TNFR2并沙利度胺處理后的對照組和UR組。UR、LY和DK采用細(xì)胞系核仁轉(zhuǎn)染試劑盒將PcDNA3.1/TNFR2載體轉(zhuǎn)染L428細(xì)胞,上調(diào)TNFR2表達(dá),按照實(shí)際和說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,轉(zhuǎn)染后48 h收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于進(jìn)一步研究。
采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,用PrimeScript qRT-PCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,均參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用Kit試劑盒進(jìn)行PCR檢測,用Labwork軟件進(jìn)行結(jié)果分析。采用2-ΔΔCt法計算TNFR2相對表達(dá)量。引物序列:TNFR2上游5′-ACGTTCTCCAACACGACTTCATC-3′,下游5′-ATGATGACACAGTTCACCACTCC-3′;GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。
收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,加入蛋白裂解液,提取總蛋白,采用BCA試劑盒進(jìn)行定量。取300 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h,加入TNFR2(稀釋比例1∶1 000),磷酸化Akt(稀釋比例1∶1 000),Akt(稀釋比例1∶1 000),β-4-4catenin(稀釋比例1∶1 000)和GAPDH(稀釋比例1∶5 000)一抗孵育,4 ℃搖床過夜,次日PBST洗3次,每次10 min,二抗室溫孵育1 h,曝光后對蛋白進(jìn)行定量,以GAPDH作為內(nèi)參。
收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,以5×103個/孔接種于96孔板中,接種后12、24、48 h時,加入10 μL CCK-8溶液,2 h后在450 nm處讀取OD值,實(shí)驗重復(fù)3次。收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,以8×103個/孔接種于96孔板中,24 h后以不同濃度ADM(0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol/L)替代培養(yǎng)基,以0 μmol/L ADM處理的細(xì)胞作為對照組。48 h后,加入10 μL CCK-8溶液,2 h后在450 nm波長處讀取OD值,繪制細(xì)胞活力曲線,細(xì)胞活力(%)=各濃度OD值/對照組OD值×100%。
UR、LY和DK組TNFR2 mRNA和蛋白表達(dá)均高于對照組(P<0.05;圖1)。
圖1 各組細(xì)胞中TNFR2 mRNA(A)和蛋白(B和C)表達(dá)的比較
UR、LY和DK組p-Akt/Akt、β-4-4catenin均高于對照組,LY組p-Akt/Akt水平低于UR組,DK組β-4-4catenin水平低于UR組和LY組(P<0.05)。在L428細(xì)胞過表達(dá)TNFR2并采用沙利度胺處理后,沙利度胺UR組較UR組細(xì)胞中p-Akt/Akt及β-4-4catenin水平均明顯降低(P<0.05;圖2和表1)。
圖2 各組Akt和WNT信號通路蛋白相對表達(dá)的比較
表1 各組Akt和WNT信號通路蛋白表達(dá)的比較(n=6)
12、24、48 h時UR組、LY組、DK組細(xì)胞活力OD值均高于對照組,LY組和DK組低于UR組(P<0.05;表2)。在L428細(xì)胞過表達(dá)TNFR2并采用沙利度胺處理后,沙利度胺UR組12、24、48 h OD值均低于UR組(P<0.05;表2)。
表2 作用不同時間各組細(xì)胞增殖能力的比較
對照組、UR、LY和DK組ADM的IC50分別為0.821、1.785、1.135和1.195 μmol/L,UR、LY和DK組IC50高于對照組,LY和DK組IC50低于UR組(P<0.05;圖3)。在L428細(xì)胞過表達(dá)TNFR2并采用沙利度胺處理后,對照組、沙利度胺對照組、UR組、沙利度胺UR組IC50分別為0.762、0.798、1.815和1.154 μmol/L,沙利度胺UR組IC50低于UR組(P<0.05;圖3)。
圖3 各組ADM抑制L428細(xì)胞活力的IC50比較
腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子是三聚體結(jié)合蛋白家族,與腫瘤壞死因子家族受體不同成員的胞質(zhì)區(qū)域和Toll樣受體復(fù)合物的組成部分相互作用[7]。TRAF2定位于9q34.3,編碼501個氨基酸,在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),參與癌癥的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種病理生理進(jìn)程,但在淋巴瘤的研究中較少報道[8-9]。目前TNFR2在淋巴瘤中報道僅限于血漿中可溶性的TNFR2,既往研究顯示,血漿高水平TNFR2與HL患者臨床特征和預(yù)后不良相關(guān)[10]。Heemann等[11]研究顯示,循環(huán)血液中可溶性TNFR2水平≥2.16 μg/L時,患者總生存時間縮短相對風(fēng)險增加2.07倍,無進(jìn)展生存時間縮短風(fēng)險增加2.49倍。Nakamura等[12]研究顯示,接受R-CHOP方案化療的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者,循環(huán)高水平可溶性TNFR2與預(yù)后較差相關(guān)。這些研究均顯示,血漿中可溶性TNFR2與淋巴瘤預(yù)后相關(guān),但TNFR2在淋巴瘤中的具體作用尚不明確。
Akt途徑是介導(dǎo)各種生理和病理通路的關(guān)鍵性通路,參與到了肝癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤等多種腫瘤的惡性生物學(xué)功能中,如腫瘤細(xì)胞增殖、存活、黏附、耐藥性和遷移等[13]。一項膽管癌研究顯示,使用中和抗體抑制TNFR2表達(dá)可阻斷乳腺癌細(xì)胞中Akt信號通路的激活[14]。Wnt/β-4-4catenin信號已被證明是癌癥發(fā)生的核心,可影響細(xì)胞增殖、遷移、耐藥性等多種惡性腫瘤細(xì)胞相關(guān)特征[15]。本研究中上調(diào)TNFR2表達(dá)可增加p-Akt/Akt比值和β-4-4catenin蛋白表達(dá)水平,Akt抑制劑LY294002可抑制TNFR2過表達(dá)所致L248細(xì)胞增殖,Wnt/β-4-4catenin抑制劑DKK1也可抑制TNFR2過表達(dá)導(dǎo)致的L248細(xì)胞增殖,結(jié)果提示TNFR2過表達(dá)與淋巴瘤L428細(xì)胞增殖相關(guān),Akt和WNT/β-4-4catenin途徑可能是TNFR2促進(jìn)腫瘤增殖的重要機(jī)制。有研究報道,沙利度胺可以作為TNFR2的抑制劑[16],為了觀察L428后續(xù)的生物學(xué)惡性行為是否通過TNFR2,在過表達(dá)TNFR2后,使用沙利度胺對TNFR2進(jìn)行抑制后,L428細(xì)胞的p-Akt/Akt比值和β-4-4catenin的表達(dá)水平明顯下降,同時沙利度胺處理后的細(xì)胞增殖率明顯降低。
ADM是治療淋巴瘤的常規(guī)化療藥物,通過嵌合在DNA堿基對之間干擾轉(zhuǎn)錄過程,阻止mRNA合成,對各期細(xì)胞均有治療作用,但長期使用易產(chǎn)生耐藥性,藥物獲得性耐藥是治療的巨大阻礙,研究淋巴瘤耐藥機(jī)制和逆轉(zhuǎn)耐藥是臨床亟待解決的問題[17]。本研究中,UR組IC50顯著高于對照組,提示TNFR2表達(dá)增加可能與淋巴瘤L428細(xì)胞ADM耐藥性相關(guān),進(jìn)一步研究顯示,抑制Akt和Wnt/β-4-4catenin通路均可部分逆轉(zhuǎn)TNFR2表達(dá)增加導(dǎo)致的ADM耐藥,同時采用沙利度胺對TNFR2進(jìn)行抑制后,也可以部分逆轉(zhuǎn)TNFR2表達(dá)增加導(dǎo)致的ADM耐藥。本結(jié)果與既往循環(huán)可溶性TNFR2和淋巴瘤預(yù)后的報道相一致[17]。
綜上所述,TNFR2通過Akt和WNT/β-4-4catenin途徑促進(jìn)淋巴瘤L428細(xì)胞增殖和ADM耐藥,TNFR2可能是淋巴瘤治療的新靶點(diǎn)。