肺腺癌中細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族預(yù)后價(jià)值的生物信息學(xué)分析

白皓天， 李婭蘭， 梁 霄， 張?bào)揸唬?張倩倩， 孫淑慧， 楊 婧， 王 銳

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江省哈爾濱市 150040)

細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白家族(cell division cycle-associated，CDCAs)由8個(gè)成員(CDCA1～8)組成，是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的重要組成部分，在肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)中表現(xiàn)異常[1]。此外，免疫治療在癌癥治療過(guò)程中起到了重要的作用，對(duì)免疫浸潤(rùn)更詳細(xì)的了解有助于發(fā)展免疫治療的理論基礎(chǔ)。在中國(guó)，肺癌的發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中位居第一位，LUAD是肺癌的主要類型之一[2]。臨床上75%的患者被確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移或者已處于癌癥晚期，預(yù)后生存率僅為15%左右[3]。本文通過(guò)對(duì)LUAD中CDCAs預(yù)后價(jià)值的生物信息學(xué)分析，以對(duì)其潛在功能和預(yù)后分析提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

LUAD組織與正常組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)均來(lái)自于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(www.oncomine.org)；GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)；Kaplan-Meier繪圖工具(http://kmplot.com/analysis/)；cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(www.cbioportal.org)；GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genemania.org)；String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)；TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)CDCAs表達(dá)

Oncomine由86 733個(gè)樣本和715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集所組成，數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了全基因組表達(dá)分析數(shù)據(jù)以及所有癌癥的微陣列信息。將LUAD信息導(dǎo)入Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行處理，設(shè)置倍數(shù)為2，顯著性閾值為10%，通過(guò)LUAD組織和正常組織的對(duì)比檢測(cè)CDCAs水平。

1.3 GEPIA與Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)

GEPIA是可以進(jìn)行在線分析的數(shù)據(jù)庫(kù)，由數(shù)千個(gè)腫瘤和正常組織樣本組成[4]。將LUAD信息導(dǎo)入GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行處理。通過(guò)GEPIA對(duì)腫瘤與正常組織的基因表達(dá)進(jìn)行差異分析、病理分期分析以及相關(guān)的預(yù)后分析。

Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)[5]用于預(yù)測(cè)LUAD中CDCAs的預(yù)后意義。運(yùn)用該工具對(duì)CDCAs mRNA在LUAD中的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。分別設(shè)置生存期為總生存期(overall survival，OS)與無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)，癌種設(shè)置為L(zhǎng)UAD，對(duì)不同病理狀態(tài)患者的預(yù)后情況進(jìn)行分析。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)蛋白相互作用與免疫浸潤(rùn)相關(guān)性

cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了245項(xiàng)大規(guī)模的癌癥基因組學(xué)的數(shù)據(jù)集。運(yùn)用cBioPortal分析CDCAs與共表達(dá)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以將癌癥基因組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可視化的腫瘤基因組圖譜，進(jìn)而從cBioPortal中獲取CDCAs基因的改變情況。

GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDCAs功能，分別設(shè)置檢索基因CDCA1～8，評(píng)估CDCAs的預(yù)測(cè)價(jià)值。

String是可以將蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行可視化的數(shù)據(jù)庫(kù)[6-7]。將CDCAs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行可視化分析，設(shè)置互作分值高可信(high confidence：0.400)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有互作關(guān)系的節(jié)點(diǎn)，即可得到CDCAs蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析、收集并整合CDCAs的潛在相互作用。

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估不同免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況以及其臨床意義[8]。在“基因模塊”中設(shè)置檢索基因?yàn)镃DCAs，限制癌癥類型為L(zhǎng)UAD，生成散點(diǎn)圖，觀察CDCAs表達(dá)與LUAD免疫浸潤(rùn)水平的關(guān)系，探討CDCAs在LUAD中B細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 LUAD患者CDCAs的差異表達(dá)結(jié)果

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示：LUAD組織中CDCA1、2、3、5、7、8的mRNA表達(dá)水平較正常組織升高(P<0.05)，CDCA4、6較正常組織升高但并不明顯(P>0.05；表1)。LUAD組織中CDCA1、2、3、4、5、7、8的蛋白表達(dá)水平均高于正常組織(P<0.05)，而CDCA6表達(dá)水平低于正常組織(P<0.05；圖1)。CDCA1、2、3、4、5、8蛋白表達(dá)與腫瘤分期比較，差異有顯著性(P<0.05；圖2)。

表1 CDCAs mRNA在不同組織中表達(dá)的比較

圖1 CDCAs蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)

圖2 CDCAs蛋白表達(dá)與肺腺癌腫瘤分期的相關(guān)性

2.2 LUAD患者CDCAs miRNA表達(dá)的預(yù)后價(jià)值分析結(jié)果

DFS和OS曲線如圖3所示。CDCA1、3、4的miRNA水平與DFS和OS均呈正相關(guān)。CDCA2、5、8均與OS呈正相關(guān)。

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDCAs mRNA與DFS和OS的相關(guān)性

Kaplan-Meier繪圖工具分別對(duì)LUAD患者CDCAs的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行亞組分析(圖4)。在LUAD患者中，CDCA1～8 mRNA的高表達(dá)均與OS呈正相關(guān)。

圖4 kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDCAs mRNA在肺腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值

2.3 CDCAS基因改變、表達(dá)以及蛋白相互作用分析結(jié)果

在1 678例LUAD患者樣本中，CDCA1～8分別有7%、5%、1.8%、4%、0.4%、4%、1.2%和0.9%的樣本發(fā)生了改變(圖5)。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共獲得8個(gè)節(jié)點(diǎn)與19條連線。GeneMANIA的結(jié)果還顯示差異表達(dá)的CDCAs及其相關(guān)分子(如CENPF、SKA1、BIRC5、AURKB、CDC20、CEP55和PLK1)的功能主要與染色體位置、著絲粒、染色體分離調(diào)控和赤道板集合等有關(guān)(圖6)。

圖5 肺腺癌患者CDCAs的基因改變及表達(dá)情況

圖6 肺腺癌患者CDCAs蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 LUAD患者CDCAs免疫浸潤(rùn)分析

如圖7所示，在LUAD中，CDCA1的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)。CDCA2與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。CDCA3的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。CDCA4在細(xì)胞中的表達(dá)與B細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)，與樹(shù)突狀細(xì)胞無(wú)顯著相關(guān)。CDCA5與巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。CDCA6的表達(dá)與除CD4+T細(xì)胞外的5種宿主免疫細(xì)胞浸潤(rùn)均呈負(fù)相關(guān)。CDCA7的表達(dá)與巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞均呈正相關(guān)。CDCA8的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)。

圖7 LUAD中CDCAs蛋白的差異表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

3 討 論

CDCAs在腫瘤中高度表達(dá)，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、減少腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。CDCA1，也稱為NUF2，是對(duì)核分裂穩(wěn)定至關(guān)重要的蛋白質(zhì)編碼。Tokuzum等[9]通過(guò)研究證實(shí)CDCA1-siRNA抑制WM115和SKMEL2細(xì)胞的增殖，但并不能減弱惡性黑色素瘤患者腫瘤細(xì)胞的侵襲或遷移。分析結(jié)果顯示，CDCA1在LUAD組織中高表達(dá)，并且CDCA1與患者的生存率和免疫浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)。CDCA2是一種與蛋白質(zhì)磷酸酶結(jié)合的核蛋白，在細(xì)胞周期中參與DNA損傷。研究表明CDCA2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等癌癥中是非常有效的預(yù)后標(biāo)志物，可用于患者生存率低和惡性程度高的標(biāo)志[10]。CDCA3是SKP1-Cullin -RING-F-box泛素連接酶復(fù)合物的一部分，可降解內(nèi)源性細(xì)胞周期抑制劑WEE1從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[11]。HoxB3可以與CDCA3啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并反式激活CDCA3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)前列腺癌的進(jìn)展。CDCA4是轉(zhuǎn)錄因子E2F的靶基因，與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞、細(xì)胞生長(zhǎng)分化有關(guān)。Xu等[12]發(fā)現(xiàn)CDCA4在體外促進(jìn)MCF-7/ADM乳腺癌細(xì)胞的增殖并減少其凋亡。CDCA5是細(xì)胞分裂過(guò)程中姐妹染色單體凝聚和分離的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，CDCA5可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和抗凋亡，降低對(duì)順鉑注射液的敏感性[13]。CDCA6也被稱為CBX2，編碼多梳性多蛋白復(fù)合物其中的一個(gè)組成部分。CDCA6的上調(diào)和擴(kuò)增與許多類型癌癥的總生存率和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的降低呈顯著相關(guān)。本研究中CDCA6在LUAD中的表達(dá)并不十分顯著，因此，有必要對(duì)CDCA6在LUAD中的作用進(jìn)行研究。CDCA7，也稱為JPO1，被認(rèn)為是一個(gè)c-Myc靶基因，參與c-Myc介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。CDCA8，也稱為Borealin/DasraB，編碼染色體passenger復(fù)合體的一個(gè)組成部分，對(duì)染色質(zhì)的誘導(dǎo)和紡錘體形成至關(guān)重要。一項(xiàng)研究也報(bào)道了CDCA8與不良預(yù)后皮膚黑色素瘤患者[15]、乳腺癌患者[16]、結(jié)直腸癌患者和肺癌患者呈顯著相關(guān)。結(jié)果表明CDCA1、2、3、4、5、8在LUAD患者中的轉(zhuǎn)錄和翻譯上都有較高的表達(dá)。CDCAs的功能和途徑及其相鄰基因表明，這些基因主要富集于染色體、著絲粒、赤道板等位置的改變，在PI3K-Akt和AMPK信號(hào)通路以及一些癌癥和癌癥相關(guān)的信號(hào)通路也有富集。因此，CDCAs的修飾與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，這在很大程度上與蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)。

總之，通過(guò)系統(tǒng)分析CDCA家族成員在肺腺癌中的差異表達(dá)以及預(yù)后價(jià)值。CDCA1、2、3、4、5、7、8在肺腺癌組織中的表達(dá)水平顯著上升，CDCA6表達(dá)水平降低。CDCA1、3、4與LUAD患者的短期OS和DFS呈正相關(guān)，CDCA2、5、8與短期OS呈正相關(guān)。CDCA1、2、3、4、5、8與臨床腫瘤分期呈顯著相關(guān)，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。這些結(jié)果表明CDCA1、2、3、4、5、8可能是LUAD患者生存的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，差異表達(dá)CDCAs主要參與凝聚染色體著絲粒、染色體分離調(diào)控和赤道板集合等過(guò)程。CDCAs的表達(dá)與LUAD腫瘤中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等6種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著相關(guān)。此項(xiàng)研究可能為肺腺癌CDCAs預(yù)后生物標(biāo)志物提供全面的分析以及新的思路，為更多的基因組學(xué)研究和后續(xù)功能探究奠定基礎(chǔ)。