低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及差異表達(dá)的長非編碼RNA的篩選*

唐尚鴻， 宋磊， 謝舒樂， 李群星， 林釗宇

1惠州市中心人民醫(yī)院兒科(廣東惠州 516001)； 2徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科(江蘇徐州 221000)； 3中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院廣東省惡性腫瘤表觀遺傳與基因調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗室(廣東廣州 510120)

低氧環(huán)境是實(shí)體瘤的一個普遍特征，尤其到腫瘤后期發(fā)展。低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞往往會發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高度浸潤性腫瘤，其細(xì)胞從原發(fā)病灶遷移到周圍正常腦組織和遠(yuǎn)處，中位生存時間<18個月[1]。這種膠質(zhì)瘤的局部侵襲性對其臨床預(yù)后較差至關(guān)重要，常常導(dǎo)致手術(shù)無法完全切除，導(dǎo)致原發(fā)灶復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和播散[2-3]。因此，闡明神經(jīng)膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的分子和生物學(xué)機(jī)制可能會發(fā)現(xiàn)新的治療方法來治療這種疾病。EMT是一種復(fù)雜的過程，其中上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間接觸并獲得間充質(zhì)特性，已被證明能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動性、侵襲性和化療耐藥性[4]。缺氧是不同組織來源的人類癌癥的普遍特征，包括膠質(zhì)瘤[5]。然而，低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤中EMT的機(jī)制仍不清楚。lncRNA被定義為長度超過200個核苷酸的RNA，并且從人類基因組轉(zhuǎn)錄，但不翻譯(非編碼)[6-7]。lncRNAs表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式，并在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[8]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS(HyClone，Logan，UT，USA)的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5%CO2常氧狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)。對于缺氧培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2，1%O2和94%N2的密封培養(yǎng)箱中孵育。

1.2 實(shí)驗分組 分為4個組。mock為空白對照組，NC-Si為陰性對照組，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)-Si、HIF-1α-Si2為實(shí)驗組。mock為僅加入轉(zhuǎn)染試劑不轉(zhuǎn)入任何載體。NC-Si為轉(zhuǎn)染雜亂序列的小干擾RNA，HIF-1α-Si、HIF-1α-Si2為轉(zhuǎn)染針對HIF-1α的目的序列干擾RNA。

1.3 長非編碼RNA芯片檢測 低氧誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞與親本細(xì)胞系之間的lncRNA芯片分析由上海康成生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d選擇對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞于6孔板進(jìn)行鋪板，次日保證細(xì)胞貼壁生長良好。將合成好的siRNA與lipo3000脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后換成普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白及RNA進(jìn)行下一步操作。

1.5 蛋白印跡實(shí)驗 配膠完畢后，將蛋白樣品變性后加入泳道，電泳完畢后，PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，脫脂奶粉室溫封閉1 h，將膜上所要檢測的膜蛋白進(jìn)行裁剪，4℃孵育抗體過夜，次日將膜置于TBST緩沖液進(jìn)行漂洗，然后室溫孵育二抗1 h，TBST緩沖液洗滌后發(fā)光液進(jìn)行曝光。Western blot和qRT-PCR檢測缺氧對EMT變化的影響。

1.6 定量實(shí)時PCR(RT-qPCR) 用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取總RNA。接下來，使用引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后如下用特定引物組擴(kuò)增：E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(正向)5′-GGAGGAGAGCGGTGGTCAAA-3′和(反向)5′-TGTGCAGCTGGCTCAAGTCAA-3′；波形蛋白(Vimentin)(正向)5′-GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT-3′和(反向)5′-TCCTCCGCCTCCTGCAGGTTCTT-3′； HOTTIP(正向)5′-AACGATGTGTGTGTGCCTTGAT-3′和(反向)5′-TGGTCCGACAGGGTGAATT-3′；GAPDH(正向)5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和(反向)5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；和U6(正向)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和(反向)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用比較循環(huán)閾值(Ct)(2-ΔΔCt)方法計算相對表達(dá)，對照組的表達(dá)設(shè)為1。

1.7 侵襲遷移實(shí)驗 取對數(shù)期生長腫瘤細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞濃度控制在1×105個/mL，細(xì)胞遷移實(shí)驗：1×105個細(xì)胞/200 μL無血清培養(yǎng)基接種于Transwell小室上室，下室加入500 μL含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后，棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，沖洗，浸泡0.05%結(jié)晶紫染色5 min，PBS沖洗，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。100倍放大倍數(shù)下，每個小室計10個視野，取平均值。細(xì)胞侵襲實(shí)驗：首先將50 μL Matrigel(無血清培養(yǎng)基稀釋1∶4，BD)加入Transwell小室上室，37℃孵育30 min，然后接種細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗，培養(yǎng)時間為24 h，其余同前遷移實(shí)驗。

2 結(jié)果

2.1 缺氧以HIF-1α依賴的方式誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 在低氧條件下，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)增加，而E-cadherin的表達(dá)則以時間依賴性方式顯著降低。在U251細(xì)胞中觀察到類似的結(jié)果(圖1)。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了mRNA水平的這些變化(圖2)。在U87細(xì)胞中，侵襲和遷移能力增加了4.2～5.6倍，而在U251細(xì)胞缺氧下增加了4.3～4.2倍(圖3、表1)。

圖1 蛋白免疫印跡檢測低氧條件下不同時間點(diǎn)U87和U251細(xì)胞EMT相關(guān)因子的表達(dá)

A:U87;B:U251;*與常氧比較P<0.01

A：U87細(xì)胞；B：U251細(xì)胞

缺氧條件下，U87和U251細(xì)胞的HIF-1α蛋白和mRNA水平都顯著增加(圖1、2)。HIF-1α的敲減消除了低氧對Vimentin上調(diào)的影響，并在蛋白質(zhì)和mRNA水平都下調(diào)了E-cadherin的水平(圖4、5)。侵襲遷移實(shí)驗顯示低氧對HIF-1α敲低的影響明顯受到抑制(圖6、表2)。

2.2 lncRNA芯片的篩選 在lncRNAs的不同表達(dá)中，HOTTIP是最多的上調(diào)缺氧處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞lncRNA，見圖7。

細(xì)胞遷移能力侵襲能力U87常氧21±617±8缺氧87±972±5U251常氧42±1231±11缺氧141±16108±13

圖4 蛋白免疫印跡檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-1α siRNA后HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化

A:U87;B:U251;*與NC-Si比較P<0.05

A:U87;B:U251

細(xì)胞遷移能力侵襲能力U87NC-si116±1898±21HIF-1α-si132±1728±11HIF-1α-si242±1333±9U251NC-si127±23104±20HIF-1α-si130±619±5HIF-1α-si227±721±8

2.3 缺氧并轉(zhuǎn)染HOTTIP siRNA對U87和U251細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響 低氧的膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染中HOTTIP siRNA，HOTTIP的表達(dá)水平被敲低，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力被抑制。見圖8、9及表3。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率在中國呈現(xiàn)上升趨勢。雖然近年來治療方法在不斷改進(jìn)，但因其惡性程度高、

A：低氧誘導(dǎo)細(xì)胞與親本細(xì)胞之間的長非編碼RNA芯片；B：qRT-PCR檢測芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性

A：低氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與親本細(xì)胞之間的長非編碼HOTTIP的表達(dá)變化；*與常氧比較P<0.01；B：轉(zhuǎn)染HOTTIP siRNA后HOTTIP的表達(dá)變化；*與mock、NC-Si比較P<0.01

圖8 qRT-PCR檢測低氧誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)染HOTTIP siRNA后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)

A：U87細(xì)胞；B：U251細(xì)胞

細(xì)胞遷移能力侵襲能力U87NC98±1083±8HOTTIP siRNA44±636±9U251NC134±12102±15HOTTIP siRNA46±838±4

增殖快、浸潤性強(qiáng)，手術(shù)不能完整切除、放化療不敏感，以致患者預(yù)后差。因此急需新的、更加精確的治療手段來提高患者的療效[9]。在實(shí)體瘤中，低氧是一種很普遍的現(xiàn)象，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的元素，低氧能夠抑制多種實(shí)體瘤的增殖，促進(jìn)侵襲等過程[10]。低氧引發(fā)的下游通路研究一直是一個研究熱點(diǎn)，低氧可以引起HIF的產(chǎn)生，HIF進(jìn)而促進(jìn)多種基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)多種蛋白以應(yīng)對低氧環(huán)境[11]。以往對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究主要集中與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞異常分化、細(xì)胞增殖失調(diào)、細(xì)胞外基質(zhì)降解、基底膜破壞等方面[12]。而近年關(guān)于非編碼RNA的研究越來越多，使其成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[13]。其中l(wèi)ncRNA被發(fā)現(xiàn)可以參與腫瘤基因組的修飾、參與對靶基因的調(diào)控、結(jié)合特異性DNA或RNA進(jìn)而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有文獻(xiàn)[14]報道，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)lncRNA ATB可明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程，這說明lncRNA ATB與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展可能存在密切關(guān)系。HOTTIP是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)HOTTIP可能在腎癌、胰腺癌和乳腺癌中參與到調(diào)控腫瘤的增殖、凋亡和分化等方面，因此HOTTIP可能在癌癥發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用，然而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中l(wèi)ncRNA HOTTIP的作用機(jī)制仍不清楚。

本研究我們通過lncRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)，相比親本細(xì)胞，低氧誘導(dǎo)后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA HOTTIP表達(dá)水平明顯升高，qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTTIP在低氧環(huán)境下的表達(dá)水平確實(shí)明顯升高。低氧條件下，敲低HOTTIP表達(dá)水平時，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞系EMT的發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移能力受到抑制，并發(fā)現(xiàn)在低氧條件時，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是以依賴于HIF-1α的方式誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移能力。在人類實(shí)體瘤發(fā)生、發(fā)展中，缺氧是普遍現(xiàn)象。新近的證據(jù)顯示缺氧在神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤[14]、侵襲、遷移[15]和化療耐藥[16]中起著關(guān)鍵作用。此外，EMT已被證明是癌癥轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟[6]。Quagliata等[17]報道在膠質(zhì)瘤中缺氧誘導(dǎo)了腫瘤EMT的發(fā)生。而本研究中，我們進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α可能參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和EMT的發(fā)生。

總之，lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到重要作用，可以參與調(diào)控腫瘤的多種生物學(xué)行為。本研究通過RNA芯片篩選出lncRNA HOTTIP在惡性膠質(zhì)瘤缺氧條件下表達(dá)水平明顯升高，并通過細(xì)胞功能實(shí)驗證實(shí)了lncRNA HOTTIP可能影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移侵襲能力，并誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。同時證實(shí)了HIF-1α可能參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和EMT的發(fā)生。我們將進(jìn)一步探究lncRNA HOTTIP是否通過調(diào)控HIF-1α，進(jìn)而參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和EMT的發(fā)生，為研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤找到新的治療途徑。