膿毒癥兒童CD4+T淋巴細胞肌醇需求酶1信號通路的變化

商躍云， 張慧， 林書祥， 舒劍波

1天津市兒童醫(yī)院急診內(nèi)科(天津 300134)； 2天津市兒科研究所(天津 300134)

膿毒癥(sepsis)是由感染、創(chuàng)傷等因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是臨床常見的急危重癥，是危重患者死亡的主要原因之一。既往把膿毒癥定義為感染導(dǎo)致的全身反應(yīng)綜合征，2016年2月，美國重癥醫(yī)學(xué)會與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會聯(lián)合發(fā)布了膿毒癥3.0定義，即膿毒癥是宿主對感染的特異性反應(yīng)導(dǎo)致的威脅生命的器官功能障礙。新定義更強調(diào)了膿毒癥“器官功能障礙”的結(jié)果與本質(zhì)。多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)在膿毒癥中具有非常重要的地位，具有來勢兇猛、進展迅速、預(yù)后差的特點。目前膿毒癥引起MODS的機制并不十分明確，因其難治性及高病死率一直是急危重癥的重點和難點[1]。外周血CD4+T淋巴細胞參與T細胞活化信號的傳導(dǎo)和免疫激活，在膿毒癥所致MODS中起重要作用，影響膿毒癥患者的預(yù)后[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞特有的膜性細胞器，遍布于整個細胞質(zhì)中，是連接核膜和胞膜的主要組成，為細胞內(nèi)蛋白的折疊、修飾、加工、合成提供場所，是細胞的蛋白加工廠。外來刺激的作用下，未折疊或錯誤折疊的蛋白蓄積過度，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ERS在炎癥反應(yīng)、細胞死亡及氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用[3]。其中細胞凋亡相關(guān)肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)通路是ERS未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的經(jīng)典通路，IRE1通路的激活意味著ERS的存在[4]。本研究通過檢測膿毒癥外周血CD4+T細胞免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(binding immunoglobulin heavy chain protein，Bip)、IRE1及X-盒結(jié)合蛋白1(Xbox-binding protein 1，XBP1)水平變化，初步探討CD4+T細胞ERS IRE1通路在膿毒癥中的作用，以期為其治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1—12月于天津市兒童醫(yī)院確診的膿毒癥兒童，根據(jù)出院結(jié)局分為存活組和死亡組，每組隨機選取30例，納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且經(jīng)過血、尿、痰標(biāo)本培養(yǎng)及X線胸片、超聲、CT檢查確定感染部位。同時選取天津市兒童醫(yī)院同期體檢的健康兒童30例為對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患有自身免疫性疾病、正在應(yīng)用免疫抑制劑、AIDS和腫瘤患者。對照組30例，男15例，女15例，年齡(6.27±3.50)個月；存活組30例，男14例，女16例，年齡(7.37±3.92)個月；死亡組30例，男16例，女14例，年齡(7.03±3.76)個月，3組性別和年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.27，F(xiàn)=0.69，P>0.05)，有可比性。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且受試者家長均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 診治方法 所有確診患兒均以邁瑞(Mindray)PM-9000便攜式多參數(shù)監(jiān)護儀予生命體征監(jiān)測，以邁瑞全自動五分類血液分析儀BC-5140行血常規(guī)，以優(yōu)利特(Urit)全自動生化分析儀8020A行電解質(zhì)、肝腎功能、心肌損傷標(biāo)志物、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及血乳酸，以貝克曼ACLTOP 300全自動血凝分析儀行D-二聚體，以雅培(ABBOTT)i2000全自動免疫分析儀行腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)，以雷度(Radiometer)ABL80血氣分析儀行血氣分析等相關(guān)檢查，經(jīng)過血、尿、痰標(biāo)本培養(yǎng)及X線胸片、超聲、CT檢查確定感染部位。并予心電圖、超聲心動圖監(jiān)測心臟損害。根據(jù)小兒危重病例評分法(草案)進行小兒危重病例評分(pediatric clinical illness score，PCIS)[6]并根據(jù)2016年膿毒癥與膿毒性休克處理國際指南[7]給予膿毒癥集束化治療，包括液體復(fù)蘇、抗生素、糖皮質(zhì)激素等治療。

1.2.2 分離外周血CD4+T淋巴細胞 對照組、生存組及死亡組于確診后抽取外周靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝靜脈血，聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(北京索萊寶科技有限公司，批號：P8610)分離外周血單個核細胞。按試劑盒(Invitrogen Technologies Inc，USA，批號：15596-06)說明，采用免疫磁珠分離外周血CD4+T淋巴細胞，錐蟲藍染色判定細胞活力>95%，流式細胞術(shù)檢測細胞純度>97%，備用。

1.2.3 Bip、IRE1及XBP1 mRNA水平的測定 取已分離外周血單個核細胞，按試劑盒說明書(Tiangen)步驟分離總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量，吸光度260/280比值判定純度，瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測完整性。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后(Tiangen)，進行PCR擴增。內(nèi)參照肌動蛋白(β-actin)與目的片段IRE1、ASK1及JNK的引物應(yīng)用軟件Gene Runner、并根據(jù)GenBank所發(fā)布的目的基因序列自行設(shè)計， 同時經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物序列和擴增產(chǎn)物片段長度見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，Real-time PCR)法測定mRNA水平，Real-time PCR反應(yīng)體系參照SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒(Tiangen)說明書。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸34 s，進行40個循環(huán)。溫度變化速度為3℃/s，在每個循環(huán)延伸階段檢測熒光信號，進行實時監(jiān)控，最后進入解鏈階段，繪制產(chǎn)物的融解曲線，以了解樣品擴增的特異性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。數(shù)據(jù)的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。每管樣品重復(fù)測定4次，Real-time PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，用GelDoc凝膠成像分析儀掃描電泳結(jié)果，根據(jù)產(chǎn)物分子量大小來進一步鑒定產(chǎn)物特異性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)數(shù)據(jù)用2檢驗，計量數(shù)據(jù)(均符合正態(tài)分布)以表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析(One Way ANOVA)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義者進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥存活組與死亡組生化指標(biāo)比較 存活組與死亡組CRP、PCT、IL-6、血乳酸、D-二聚體、BNP及PCIS的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。存活組CRP、PCT、IL-6、血乳酸、D-二聚體及BNP均低于死亡組，PCIS高于死亡組。見表2、3。

項目例數(shù)CRP(mg/L)PCT(μg/L)IL-6(ng/L)血乳酸(mmol/L)D-二聚體(μg/L)BNP(ng/L)PCIS存活組3075.17±13.094.35±1.4023.05±7.412.67±0.85245.65±78.48204.71±65.4076.67±12.09死亡組30100.20±11.678.01±1.1072.13±9.933.99±1.03638.70±204.05304.14±97.1769.03±9.54t值7.8111.2721.695.419.854.652.71P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

表3 膿毒癥存活組與死亡組生化指標(biāo)比較 95% CI

2.2 對照組、存活組與死亡組Bip、IRE1及XBP1 mRNA相對表達水平的比較 對照組、存活組與死亡組Bip、IRE1及XBP1 mRNA相對表達水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，存活組Bip、IRE1及XBP1 mRNA相對表達水平高于對照組(均P<0.01)，而低于死亡組(均P<0.01)。見表4、5。

項目例數(shù)BipIRE1XBP1對照組301.00±0.271.00±0.32 1.00±0.12存活組302.22±0.32? 3.21±0.44? 4.45±0.61?死亡組303.26±0.36?△6.86±0.80?△△10.22±1.19?△△F值503.83842.921 081.92P值<0.01<0.01<0.01

*與對照組比較P<0.01；與存活組比較△P<0.05，△△P<0.01

表5 3組Bip、IRE1及XBP1 mRNA相對表達水平比較 95% CI

*與對照組比較P<0.01；與存活組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.3 Real-time PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 產(chǎn)物位于預(yù)期位置，進一步確定產(chǎn)物特異性，見圖1。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是新合成的多肽鏈折疊成熟的場所。不同生理病理因素阻礙新合成多肽鏈的折疊成熟，致大量未折疊和錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，為應(yīng)對這種紊亂產(chǎn)生的一系列應(yīng)激反應(yīng)，稱為ERS，包括UPR、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應(yīng)和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)等[8]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊形態(tài)的蛋白聚集時，固有的伴侶蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的腔面解離下來，結(jié)合到未折蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白與伴侶蛋白分離從而被激活，啟動UPR。這些跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的蛋白一般是N-端向腔內(nèi)，C-端向胞漿。正常情況下這些蛋白的N-端結(jié)合了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Bip，阻止了蛋白之間的聚集。當(dāng)存在異常折疊蛋白堆積時，Bip解離下來，跨膜蛋白之間聚集活化，啟動UPR。IRE1、雙鏈依賴的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和激活轉(zhuǎn)錄因子6作為UPR通路中的3個關(guān)鍵因子，在UPR時有序激活，并發(fā)揮作用，降低未折疊蛋白濃度[9]。多種因素如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、同型半胱氨酸等化學(xué)物質(zhì)處理、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過快以至于超過蛋白折疊能力、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂、卵磷脂合成障礙等多種物理、化學(xué)或遺傳因素等均可引發(fā)ERS，刺激過強或過久則會發(fā)生細胞損傷及炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致致細胞凋亡[10]。正常狀態(tài)下，Bip與IRE1結(jié)合位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上處于無活性狀態(tài)，ERS時，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積使Bip從IRE1解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合未折疊蛋白，解離后的IRE1構(gòu)象和極性發(fā)生變化，磷酸化并二聚化，從而激活其RNA酶的活性，改變XBP1 mRNA的開放閱讀框，其翻譯產(chǎn)物XBP1能促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Bip、鈣網(wǎng)蛋白等表達，以減輕或中止ERS，從而恢復(fù)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[11]。因此Bip和XBP1表達上調(diào)常被當(dāng)作ERS的標(biāo)志[12]。

1：DNA Marker；2～4：IRE1；5～7：β-actin；8～10：XBP1；11～12：Bip

膿毒癥是指因感染引起宿主炎癥和免疫反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，膿毒癥常伴有免疫紊亂，主要表現(xiàn)為T淋巴細胞亞群的功能紊亂，促炎介質(zhì)和化學(xué)因子釋放，細胞因子風(fēng)暴造成MODS[13-14]。近年機體免疫反應(yīng)及ERS成為膿毒癥研究的熱點，但多限于細胞或動物實驗[15]，人體膿毒癥ERS的相關(guān)研究較少，且尚未見膿毒癥CD4+T淋巴細胞ERS存在及所起作用的研究報道。

本研究證實，膿毒癥CD4+T淋巴細胞Bip、IRE1及XBP1 mRNA相對表達水平升高，且死亡組CD4+T淋巴細胞Bip、IRE1及XBP1 mRNA相對表達水平高于生存組，提示膿毒癥CD4+T淋巴細胞存在ERS，且ERS是由IRE1途徑的活化實現(xiàn)，且ERS IRE1途徑的活化程度與病情的嚴(yán)重程度可能相關(guān)。輕度適當(dāng)?shù)腅RS可清除未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白，促進內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；感染嚴(yán)重，刺激過強則導(dǎo)致未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白不能及時清除，細胞穩(wěn)態(tài)不能及時回復(fù)，激活相關(guān)途徑誘導(dǎo)細胞壞死/凋亡，CD4+T淋巴細胞Bip、IRE1及XBP1 mRNA表達水平的明顯升高意味著大量CD4+T淋巴細胞發(fā)生壞死/凋亡，CD4+T細胞的凋亡還影響了其在信號傳導(dǎo)中的作用，產(chǎn)生大量的炎性因子[16]，從而參與膿毒癥及MODS的發(fā)生、發(fā)展[17]。故而推測抑制ERS，可能減輕細胞凋亡，增加膿毒癥的存活率。

膿毒癥病理生理機制較為復(fù)雜，即使通過積極治療仍效果欠佳，與ERS及其介導(dǎo)的細胞壞死/凋亡和不受控制的炎性反應(yīng)有關(guān)。探索ERS在膿毒癥中的具體機制，嘗試對ERS通路進行干預(yù)，可能是將來膿毒癥治療的新途徑。