草地貪夜蛾在玉米-小麥寄主轉(zhuǎn)換中的轉(zhuǎn)錄組分析

王斯亮，邵 越，閆成進(jìn)

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州 325000; 2.溫州市植物保護(hù)與土壤肥料管理站，浙江 溫州 325000)

草地貪夜蛾()原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有遷飛習(xí)性，自2016年開(kāi)始入侵非洲以來(lái)，現(xiàn)已擴(kuò)散至世界各地，是一種破壞力強(qiáng)的重大入侵害蟲(chóng)。草地貪夜蛾寄主范圍廣，已知能為害76科353種植物，主要包括禾本科106種、菊科31種和豆科31種，重點(diǎn)為害玉米、小麥、水稻、高粱、甘蔗、棉花等作物。草地貪夜蛾由于不同的寄主偏好性，分化形成了“玉米型”(主要取食玉米、棉花和高粱)和“水稻型”(主要取食水稻和牧草)兩個(gè)亞群，二者在形態(tài)學(xué)上沒(méi)有顯著差異，但是在交配行為、信息素成分等方面有明顯的差別。張磊等鑒定我國(guó)的草地貪夜蛾入侵種群來(lái)源于美國(guó)的佛羅里達(dá)州，該種群大部分呈現(xiàn)核基因“玉米型”，線粒體基因“水稻型”的特征，故稱(chēng)之為“特殊玉米型”，推測(cè)其可能為“水稻型”母本與“玉米型”父本雜交產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)目前報(bào)道的草地貪夜蛾寄主植物主要包括玉米、小麥、水稻、青稞、甘蔗、花生、馬鈴薯、甘藍(lán)等。

草地貪夜蛾適生區(qū)域廣。北回歸線以南地區(qū)，草地貪夜蛾可以周年繁殖，無(wú)滯育。在中國(guó)，長(zhǎng)江中下游地區(qū)和東南丘陵地帶是草地貪夜蛾的高度適生區(qū)。然而冬季草地貪夜蛾的越冬蟲(chóng)態(tài)和冬季寄主是需要調(diào)查研究的問(wèn)題。入侵我國(guó)的草地貪夜蛾以“玉米型”和“特殊玉米型”為主，雖然草地貪夜蛾本身具有多食性，但在飼喂不同寄主植物的實(shí)驗(yàn)中，草地貪夜蛾明顯表現(xiàn)出對(duì)玉米的偏好。在廣東地區(qū)的1—3月，草地貪夜蛾仍然能以幼蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)為害并安全越冬，并且為害分布與冬種玉米區(qū)范圍一致，極少數(shù)在甘蔗上發(fā)現(xiàn)，而在香蕉、花生、馬鈴薯等作物未見(jiàn)草地貪夜蛾。安徽和江蘇地區(qū)均在10月發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾為害早播小麥，其中安徽壽縣小麥平均被害株率高達(dá)77.51%，蘇北地區(qū)小麥平均被害株率高達(dá)52.60%。12月上旬以后，主要在云南、四川冬麥區(qū)發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾為害。已有多種實(shí)驗(yàn)表明，草地貪夜蛾取食小麥能夠完成生活史。由此可見(jiàn)，小麥?zhǔn)遣莸刎澮苟甑臐撛谠蕉闹髦?，我?guó)南方的冬小麥種植區(qū)，尤其是前茬種植玉米的小麥田，很可能成為草地貪夜蛾的冬季庇護(hù)場(chǎng)所。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析草地貪夜蛾在取食玉米和小麥后基因表達(dá)水平變化，探究草地貪夜蛾在寄主轉(zhuǎn)換過(guò)程中的內(nèi)在適應(yīng)性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)來(lái)源

草地貪夜蛾幼蟲(chóng)于2019年10月16日在溫州市藤橋鎮(zhèn)溫州種子種苗科技園(北緯28°5′42″，東經(jīng)120°30′59″)玉米上采集，在人工氣候箱(RXZ-500D-LED，寧波江南儀器廠)內(nèi)培育數(shù)代，箱內(nèi)溫度25 ℃，濕度70%，光照周期為12 L/12 D。

1.2 取食轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)

用玉米葉喂養(yǎng)初孵幼蟲(chóng)直至5齡初(蛻皮后24 h內(nèi))，將幼蟲(chóng)放入35 mm培養(yǎng)皿中單獨(dú)飼養(yǎng)，分成3組，每組分別飼喂玉米葉、小麥葉、人工飼料(參照華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的配方，主要成分為黃豆粉、麥麩等)。3 d后，提取單頭幼蟲(chóng)總RNA，每組做3次生物重復(fù)。

1.3 RNA提取

將草地貪夜蛾幼蟲(chóng)放入試劑RNA-easy Isolation Reagent(南京諾唯贊生物科技有限公司)中研磨，參照該試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)應(yīng)的方法操作提取RNA，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與拼接

轉(zhuǎn)錄組委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司采用Nova seq6 000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。測(cè)序前使用Nanodrop和Agilent 2 100檢測(cè)RNA的濃度和純度以及完整性。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)Raw Data，通過(guò)去除測(cè)序接頭，過(guò)濾低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量的Clean Data，并使用軟件FastQc(v0.11.8)對(duì)Clean Data進(jìn)行質(zhì)量控制，計(jì)算Q30等指標(biāo)。使用軟件Trinity(v2.4.0)對(duì)得Clean Data的Reads進(jìn)行拼接組裝，生成每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本序列(transcript)，取每條基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。

1.5 Unigene功能注釋

使用軟件BLAST將Unigene序列與NR(Non-Redundant Protein Sequence Database)、Swiss-Prot、GO(Gene Ontology)、COG(Clusters of Orthologous Groups)、KOG(euKaryotic Orthologous Groups)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，參數(shù)設(shè)置E-value<10。預(yù)測(cè)Unigene的氨基酸序列，使用軟件HMMER將氨基酸序列與Pfam(Protein family)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。綜合以上數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，獲得Unigene的功能注釋信息。

1.6 差異表達(dá)分析

采用軟件Bowtie2(V4.4.7)將測(cè)序得到的Reads與Unigene庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，結(jié)合軟件RSEM進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值表示對(duì)應(yīng)Unigene的表達(dá)豐度。差異表達(dá)分析中，使用R(v3.6.2)中的DESeq2程序包計(jì)算差異倍數(shù)(FC，F(xiàn)old Change)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2(FC)|≥1且FDR<0.05。篩選到差異基因后，根據(jù)超幾何分布原理進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)中，被測(cè)的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)分為3組，其中處理組2組，分別是飼喂小麥葉的FAWw組和飼喂人工飼料的FAWsl組，對(duì)照組1組，為飼喂玉米葉的FAWym組。取5齡初幼蟲(chóng)(蛻皮后24 h內(nèi))開(kāi)始飼喂，3 d后取樣提取總RNA，每組3個(gè)生物重復(fù)，共9個(gè)RNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。樣本測(cè)序并過(guò)濾得到Clean Data(表1)，結(jié)果顯示，Q30的比例均達(dá)到92%以上(堿基質(zhì)量值Q30對(duì)應(yīng)堿基識(shí)別精度達(dá)到99.9%)，未識(shí)別堿基(N)的比例均為0，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

表1 草地貪夜蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(Clean Data)

將Clean Data中的Reads進(jìn)行混合組裝，最終得到66 407條Unigene，平均長(zhǎng)度為1 063.99 bp，N50長(zhǎng)度為1 768 bp。組裝的Unigene序列長(zhǎng)度全部大于300 bp，其中，長(zhǎng)度大于1 000 bp的有17 957條，占27.04%的比例，長(zhǎng)度大于2 000 bp的有8411條，占Unigene總數(shù)的12.67%(表2)。

表2 草地貪夜蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果(Unigene)

2.2 Unigene功能注釋

將組裝得到的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)Unigene序列，與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將Unigene的預(yù)測(cè)氨基酸序列與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最終獲得18 868條有注釋信息的Unigene(表3)。其中在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到的Unigene有18 645條，占比98.82%。通過(guò)NR庫(kù)的注釋信息，獲得草地貪夜蛾幼蟲(chóng)Unigene序列與近緣種屬的同源序列相似情況，其中匹配最多的是斜紋夜蛾的同源序列，共有13 248條，占NR注釋Unigene總數(shù)的71.05%，其次是棉鈴蟲(chóng)(5.77%)和煙芽夜蛾(5.49%)(圖1)。草地貪夜蛾與斜紋夜蛾為同屬近緣種，該結(jié)果表明Unigene注釋信息可參考程度較高。

圖1 草地貪夜蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigene在NR數(shù)據(jù)庫(kù)的同源物種分布

表3 草地貪夜蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組Unigene功能注釋

2.3 取食轉(zhuǎn)換后的差異表達(dá)基因

以取食玉米葉的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)為對(duì)照組(FAWym)，與取食飼料3 d后的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)(FAWsl)相比，共找到6 863個(gè)差異表達(dá)基因，與取食小麥葉3 d后的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)(FAWw)相比，有542個(gè)差異表達(dá)基因(表4)，其中共同的差異表達(dá)基因有384條。在差異表達(dá)基因列表中除去未獲得注釋的基因，得到取食飼料后(FAWsl組)的差異表達(dá)基因4 607條(上調(diào)表達(dá)基因2 364條，下調(diào)表達(dá)基因2 243條)，取食小麥葉后(FAWw組)的差異表達(dá)基因432條(上調(diào)表達(dá)基因263條，下調(diào)表達(dá)基因169條)，共同的差異表達(dá)基因304條，其中在FAWw組和FAWsl組中均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的基因有82條，均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的基因有98條(表5)。

表4 差異表達(dá)基因相關(guān)統(tǒng)計(jì)

在FAWw組的上調(diào)表達(dá)基因中，有82條基因是在FAWsl組中也表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的共同上調(diào)表達(dá)基因，有94條基因?qū)儆诠餐町惐磉_(dá)基因中在FAWsl組呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的基因，87條基因?yàn)樘禺愋陨险{(diào)表達(dá)基因(表5)。去掉82條共同上調(diào)表達(dá)基因后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FAWw組表達(dá)量顯著上調(diào)的基因有大量涉及表皮相關(guān)功能，包括表皮蛋白(cuticle protein)，類(lèi)似兜甲蛋白(loricrin-like)，類(lèi)似節(jié)肢彈性蛋白原(pro-resilin-like)，表皮生長(zhǎng)因子受體激酶(epidermal growth factor receptor kinase)，內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)糖蛋白(endocuticle structural glycoprotein)等。共有32條表皮相關(guān)基因，其中27條在FAWw組上調(diào)表達(dá)，在FAWsl組下調(diào)表達(dá)(表6)。該結(jié)果表明不同食物對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的表皮發(fā)育有不同影響。

表5 特異性差異表達(dá)基因與共同差異表達(dá)基因

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)被認(rèn)為與多食性昆蟲(chóng)的寄主適應(yīng)性相關(guān)。FAWw組的差異表達(dá)基因中，細(xì)胞色素P450基因有16條，主要包含CYP4，CYP6，CYP9等家族的基因。其中下調(diào)基因有13條。在下調(diào)表達(dá)的細(xì)胞色素P450基因中，有5條屬于FAWw組特異性下調(diào)基因，有8條屬于共同下調(diào)基因(表6)。另外有2條解毒酶基因也在FAWw組和FAWsl組中共同下調(diào)，分別是谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)基因和過(guò)氧化物酶(peroxidase)基因。

表6 草地貪夜蛾取食小麥后(FAWw)的功能性差異表達(dá)基因

2.4 差異表達(dá)基因富集分析

GO包含3個(gè)大類(lèi)，分別是生物學(xué)過(guò)程(Biological Process)，細(xì)胞組分(Cellular Component)，分子功能(Molecular Function)。通過(guò)GO對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，得到在生物學(xué)過(guò)程大類(lèi)中，F(xiàn)AWw組的上調(diào)表達(dá)基因的富集趨勢(shì)與總差異表達(dá)基因的富集趨勢(shì)相似，表現(xiàn)為在免疫系統(tǒng)過(guò)程(immune system process)和細(xì)胞殺傷(cell killing)功能上顯著富集(圖2)。富集顯著程度排名靠前(前20項(xiàng))的二級(jí)功能術(shù)語(yǔ)(Term)中，有4條術(shù)語(yǔ)涉及免疫功能，分別是防衛(wèi)細(xì)菌反應(yīng)(defense response to bacterium，GO:0042742)，外來(lái)細(xì)胞殺傷(killing of cells of other organism，GO:0031640)，防衛(wèi)原生動(dòng)物反應(yīng)(defense response to protozoan，GO:0042832)，抗真菌體液免疫反應(yīng)(antifungal humoral response，GO:0019732)。而FAWsl組的差異表達(dá)基因在免疫功能上沒(méi)有明顯的富集(圖2)。在細(xì)胞組分大類(lèi)中，F(xiàn)AWw組和FAWsl組的差異表達(dá)基因在功能富集分析上差異不大，富集顯著程度最高的二級(jí)功能術(shù)語(yǔ)均為胞外區(qū)(extracellular region，GO:0005576)和細(xì)胞器膜(organelle membrane，GO:0031090)，每個(gè)術(shù)語(yǔ)內(nèi)的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量相近。在分子功能大類(lèi)中，表皮結(jié)構(gòu)成分(structural constituent of cuticle，GO:0042302)是FAWw組和FAWsl組的差異表達(dá)基因富集顯著程度最高的二級(jí)功能術(shù)語(yǔ)，然而在FAWw組表現(xiàn)為上調(diào)基因在表皮結(jié)構(gòu)成分中顯著富集，在FAWsl組則是下調(diào)基因在表皮結(jié)構(gòu)成分中顯著富集，表明取食小麥后可能有利于草地貪夜蛾幼蟲(chóng)表皮的生成。

A，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)取食小麥后(FAWw)的差異表達(dá)基因GO富集分析；B，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)取食人工飼料后(FAWsl)的差異表達(dá)基因GO富集分析。

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AWsl組的上調(diào)基因富集的代謝通路有蛋白酶體(Proteasome)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)，DNA復(fù)制(DNA replication)，錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair)等，這些通路都與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。下調(diào)基因富集的代謝通路主要與解毒代謝有關(guān)，如過(guò)氧化物酶體(Peroxisome)，細(xì)胞色素P450代謝外源物質(zhì)(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)，藥物代謝-細(xì)胞色素P450(Drug metabolism-cytochrome P450)，藥物代謝-其他酶(Drug metabolism-other enzymes)，谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)等(圖3)。人工飼料相比與植物，有毒次生代謝物明顯減少，因此，幼蟲(chóng)的解毒代謝活性顯著下降。取食小麥的FAWw組，上調(diào)基因主要在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine， serine and threonine metabolism)，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝(Cysteine and methionine metabolism)，DNA復(fù)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等通路富集。下調(diào)基因富集較顯著的通路有過(guò)氧化物酶體，苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)等(圖4)。表明取食小麥后，幼蟲(chóng)氨基酸代謝和轉(zhuǎn)換反應(yīng)更活躍。

A，F(xiàn)AWsl上調(diào)表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析；B，F(xiàn)AWsl下調(diào)表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析。

A, FAWw上調(diào)表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析；B，F(xiàn)AWw下調(diào)表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析。

3 討論

本研究中，取食玉米的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)換飼喂小麥后的差異表達(dá)基因數(shù)量(542條)比轉(zhuǎn)換飼喂人工飼料后的差異基因數(shù)量(6 863條)明顯減少，表明小麥和玉米對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)而言是非常相似的食物，可以互相替代。已有多項(xiàng)研究表明，草地貪夜蛾取食小麥后能順利完成生活史。王芹芹等試驗(yàn)結(jié)果表明，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)取食小麥和玉米的取食選擇率、存活率、體重?zé)o顯著差異。巴吐西等證明，草地貪夜蛾取食小麥后幼蟲(chóng)存活率和凈增殖率低于取食玉米，但平均世代周期、內(nèi)稟增長(zhǎng)率、周限增長(zhǎng)率無(wú)顯著差異。呂亮等發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)小麥的食物利用效率低于玉米，但幼蟲(chóng)取食小麥生長(zhǎng)發(fā)育速度比取食玉米更快。我國(guó)云南、安徽、江蘇、河南、山東、四川均有草地貪夜蛾為害小麥田。因此，草地貪夜蛾取食小麥越冬的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。

草地貪夜蛾是典型的多食性害蟲(chóng)，但是在取食上也有一定的偏好性。草地貪夜蛾有“玉米型”和“水稻型”兩個(gè)亞群，“玉米型”草地貪夜蛾取食水稻后適合度顯著降低。對(duì)“玉米型”和“水稻型”草地貪夜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)“玉米型”和“水稻型”在細(xì)胞色素P450基因家族有顯著分化，且“水稻型”的CYP4家族基因相比“玉米型”急劇擴(kuò)張，表明細(xì)胞色素P450在草地貪夜蛾寄主適應(yīng)性中起到重要作用。人工飼料里的有毒次生代謝物少，取食人工飼料后，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)細(xì)胞色素P450家族基因顯著下調(diào)，表明“適口性”更好的食物，可以減輕幼蟲(chóng)的解毒壓力。而取食小麥后，細(xì)胞色素P450家族部分基因表達(dá)量有所下調(diào)，可能表明小麥對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)而言“適口性”較好，也存在小麥的防御反應(yīng)抑制了幼蟲(chóng)解毒能力的可能性。

本研究中還發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾在取食小麥之后，大量涉及免疫功能的基因，以及表皮相關(guān)的基因，表達(dá)量顯著上調(diào)。而這一現(xiàn)象在取食人工飼料后沒(méi)有發(fā)生。表明取食小麥可以提升草地貪夜蛾抵抗逆境的能力。尤其是大量表皮相關(guān)基因，在取食小麥后表達(dá)上調(diào)，而在取食人工飼料后表達(dá)下調(diào)，這個(gè)對(duì)比結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了取食小麥對(duì)草地貪夜蛾的表皮生成有潛在的促進(jìn)作用。這些差異表達(dá)的表皮相關(guān)基因主要涉及表皮蛋白基因。表皮蛋白對(duì)昆蟲(chóng)的表皮結(jié)構(gòu)形成和穩(wěn)固有關(guān)鍵作用，如在褐飛虱()中，一些表皮蛋白的缺失會(huì)造成表皮無(wú)法正常生成。昆蟲(chóng)在受到低溫、干燥、農(nóng)藥等不利因素的影響時(shí)，表皮蛋白基因的表達(dá)量會(huì)上調(diào)。取食也會(huì)改變昆蟲(chóng)表皮蛋白基因的表達(dá)情況，如岡比亞按蚊()在血餐飼喂后，多種表皮蛋白基因的表達(dá)量發(fā)生變化。然而在草地貪夜蛾中，取食小麥對(duì)幼蟲(chóng)表皮的具體作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如取食小麥后表皮是否有增厚，是否能增強(qiáng)草地貪夜蛾的抗寒能力等。

綜上所述，小麥?zhǔn)遣莸刎澮苟暧紫x(chóng)較好的替代性寄主，秋冬季節(jié)玉米收割之后，草地貪夜蛾選擇小麥作為越冬寄主的可能性很大。我國(guó)南方氣候溫暖，多數(shù)地區(qū)種植秋玉米和冬小麥。以溫州為例，溫州地區(qū)近年來(lái)的12月至次年2月平均氣溫均在10 ℃左右(溫州氣象局，http://www.wz121.com/menuDetail)，2019年度種植玉米面積6 097 hm，小麥面積602 hm(溫州市統(tǒng)計(jì)局，http://wztjj.wenzhou.gov.cn/art/2020/11/11/art_1468706_58725761.html)，是適宜草地貪夜蛾越冬的地帶。一些零星調(diào)查顯示，溫州地區(qū)在1月仍能夠在玉米田邊的禾本科雜草上以及殘留的玉米株上發(fā)現(xiàn)4～6齡的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)。需加強(qiáng)冬季小麥田的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)及蛹的普查，尤其是前茬種植玉米的小麥田。