耐鹽促生芽孢桿菌的篩選及其對(duì)鹽脅迫下燕麥生長(zhǎng)的影響

李麗艷，譚海霞，李 婧，王連龍，杜迎輝，徐志文

(1.領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，河北 秦皇島 066000； 2.河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 秦皇島 066000； 3.河北環(huán)境工程學(xué)院 生態(tài)學(xué)系，河北 秦皇島 066000)

鹽堿地是重要的后備土地資源，為確保糧食安全，挖掘鹽堿地的生產(chǎn)潛力成為農(nóng)業(yè)開發(fā)的重要研究?jī)?nèi)容。按照生態(tài)選擇種植適合的耐鹽堿植物，是實(shí)現(xiàn)鹽堿地利用的有效途徑之一。燕麥(L.)為禾本科燕麥草屬植物，是糧飼兼用作物，生態(tài)適應(yīng)性廣，具有耐鹽堿的特點(diǎn)，是可用于鹽堿地改良利用的作物之一。

鹽脅迫是制約作物生長(zhǎng)的主要因素之一。武俊英等認(rèn)為，高鹽(含鹽量2%)脅迫下，燕麥幼苗生長(zhǎng)會(huì)受到嚴(yán)重抑制。賴弟利等探究了鹽脅迫對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)及其生理生化性狀的影響，認(rèn)為低鹽環(huán)境對(duì)燕麥生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但當(dāng)鹽濃度高于0.2%時(shí)，燕麥生長(zhǎng)即受到明顯的脅迫。

植物根際促生菌可通過分泌生長(zhǎng)素(IAA)、固氮溶磷、產(chǎn)鐵載體等途徑改善土壤環(huán)境，有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)。王丹等從新疆鹽堿土中篩選出耐鹽菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株可緩解小麥鹽脅迫，并能促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。王艷宇等篩選得到一株耐鹽堿菌DQSA1，可提高植物的耐鹽堿能力。目前，鹽脅迫下促生菌的篩選已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。

芽孢桿菌具有營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、抗逆性強(qiáng)等特性，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌種。本研究擬采取定向篩選法，從不同鹽生植物根際土中篩選具有促生效應(yīng)的耐鹽芽孢桿菌菌株，并利用盆栽試驗(yàn)研究鹽脅迫下分離到的促生芽孢桿菌對(duì)燕麥生長(zhǎng)的影響，以期為耐鹽促生菌劑和菌肥的開發(fā)提供菌種資源，為耐鹽促生菌在鹽堿地生產(chǎn)中的應(yīng)用等提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試鹽生植物采自秦皇島北戴河濕地(119°30′51″～119°31′2″E，39°50′28″～39°50′46″N)，包括鹽地堿蓬()、鹽角草()、蘆葦()、水麥冬()。采樣區(qū)屬于典型的濱海濕地，屬溫帶大陸季風(fēng)型氣候，土壤類型為濱海鹽堿土。將供試鹽生植物生長(zhǎng)土壤的基本理化性狀整理于表1，總的來看，其堿解氮、有效磷含量適中，但有機(jī)質(zhì)含量不足，pH值和水溶性鹽含量偏高，屬濱海中度鹽堿土。

表1 供試植物生長(zhǎng)土壤的基本理化性狀

試驗(yàn)用分離培養(yǎng)基為pH值9.0，含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(分別為5%、10%和15%)NaCl的LB固體培養(yǎng)基。

供試作物為北京正道生態(tài)科技有限公司提供的燕麥耐鹽品種燕王。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽菌株的分離

于研究區(qū)采集長(zhǎng)勢(shì)健壯的鹽地堿蓬、鹽角草、蘆葦、水麥冬植株，裝入無菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于24 h內(nèi)完成根際芽孢桿菌的分離。植物根際土樣品制備參考黃智華等、白文娟等的方法，并做適當(dāng)調(diào)整。將10 g根際土樣品放入無菌三角瓶中，加入90 mL無菌生理鹽水，振蕩60 min，然后80 ℃恒溫水浴30 min，接著按10倍梯度依次稀釋后涂布于含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小，挑取單菌落劃線培養(yǎng)于含有等同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)反復(fù)多次純化，保存于25%(體積分?jǐn)?shù))甘油管中，-80 ℃凍存。

1.2.2 分離株高鹽條件下促生能力檢測(cè)

為了檢測(cè)分離株在高鹽條件下是否具備明顯的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力，根據(jù)文獻(xiàn)[9-12]的方法并做適當(dāng)調(diào)整，對(duì)其在5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl條件下溶解有機(jī)磷、無機(jī)磷，產(chǎn)IAA，解鉀，固氮的能力進(jìn)行測(cè)定。參照文獻(xiàn)[13-15]的方法并做適當(dāng)調(diào)整，以含有5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，利用Salkowski比色法測(cè)定分離株在含有5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的LB培養(yǎng)基上IAA的產(chǎn)生量。

1.2.3 分離株的生態(tài)適應(yīng)性

參照文獻(xiàn)[17]的方法并做適當(dāng)調(diào)整，將篩選出的在高鹽條件下具有促生能力的分離株接種至生態(tài)適應(yīng)性檢測(cè)培養(yǎng)基中，測(cè)定其耐酸堿和耐鹽的性能，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 鹽堿土條件下分離株對(duì)燕麥的促生性能

以曹妃甸濕地鹽堿土(有機(jī)質(zhì)13.5 g·kg，有效磷71.7 mg·kg，速效鉀478 mg·kg，堿解氮44 mg·kg，水溶性鹽16.3 g·kg，pH值8.37)為基質(zhì)，與領(lǐng)先現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)閑置5 a的常規(guī)土(有機(jī)質(zhì)18.1 g·kg，有效磷97.2 mg·kg，速效鉀112 mg·kg，堿解氮100 mg·kg，水溶性鹽0.2 g·kg，pH值7.2)進(jìn)行混配，調(diào)節(jié)配比使水溶性鹽含量為5 g·kg，用于盆栽試驗(yàn)，每盆裝土1 kg。選取大小均勻一致的燕麥種子，每盆栽種10粒。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。待燕麥出苗后，澆灌篩選得到的分離株的發(fā)酵液，使盆栽土中所施菌數(shù)達(dá)到10CFU·g，10 d后第二次澆灌，整個(gè)生長(zhǎng)期等量澆灌2次，對(duì)照澆灌等量無菌培養(yǎng)液(CK)。生長(zhǎng)60 d后，測(cè)量不同處理下燕麥的株高、地上部鮮重、莖粗等生長(zhǎng)指標(biāo)，并采用WinRHIZO PRO 2013型植物根系分析系統(tǒng)(加拿大Regent)對(duì)根系指標(biāo)進(jìn)行分析。生理指標(biāo)——葉綠素含量、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量，以及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18-19]的方法進(jìn)行。

1.2.5 基于16S rDNA的分離株菌種初步鑒定

參照文獻(xiàn)[20-21]的方法對(duì)分離株進(jìn)行菌種鑒定。按常規(guī)細(xì)菌DNA提取方法制備樣品總DNA，采用細(xì)菌通用引物27F和1492R對(duì)分離株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京新時(shí)代眾合科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行在線分析，采用Mega 6.0軟件進(jìn)行比對(duì)，基于鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自舉法(Bootstrap)評(píng)估分支可信度，Bootstrap取樣值大于1 000。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)。采用DPS v12.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對(duì)有顯著(<0.05)差異的，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽芽孢桿菌的分離篩選

本研究從4種鹽生植物根際土中分離獲得13株耐鹽芽孢桿菌(表2)，其中，分離自鹽地堿蓬的有6株，分離自鹽角草的有2株，分離自蘆葦?shù)挠?株，分離自水麥冬的有2株。

表2 分離得到的耐鹽芽孢桿菌的基本信息

選擇耐鹽培養(yǎng)基上菌落長(zhǎng)勢(shì)旺盛、單菌落數(shù)量最多的3株優(yōu)勢(shì)菌(YP2、YP4、SM12)進(jìn)行菌落形態(tài)分析：YP2菌落在NA平板上呈圓形，較濕潤(rùn)，直徑2～3 mm，近乳白色，不透明；YP4芽孢近似橢圓形，中生或次端生，在NA平板上菌落呈圓形，較濕潤(rùn)，近米黃色，不透明；SM12菌落在NA平板上呈圓形，扁平，濕潤(rùn)，有黏性，具褶皺，偏乳白色。另外，經(jīng)測(cè)定，這3株菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。

2.2 分離株在高鹽條件下的促生能力

分離得到的13株菌均具有產(chǎn)IAA的活性(表3)，其中，以YP2、YP4的活性最強(qiáng)，其在5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl條件下的IAA產(chǎn)量分別達(dá)到62.1、50.0 mg·L。YP2能在以有機(jī)磷或無機(jī)磷為唯一磷源的培養(yǎng)基上產(chǎn)生較大的透明水解圈，說明其具有較強(qiáng)的溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力。另外，YP2可在鉀長(zhǎng)石和阿須貝無氮培養(yǎng)基上很好地生長(zhǎng)，說明其具有一定的解鉀和固氮的能力。YP4具有較強(qiáng)的溶解無機(jī)磷的能力，且具有一定的解鉀和固氮的能力，但不能溶解有機(jī)磷。SM12具有溶解有機(jī)磷和解鉀、固氮的能力。綜上，我們推測(cè)YP2、YP4和SM12具有較大的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力，可作為供試菌株用于促生試驗(yàn)。

表3 分離株的促生指標(biāo)

2.3 分離株的生態(tài)適應(yīng)性

YP2、YP4和SM12均可在pH值6.0～9.0的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)(表4)，其中，YP2可以在pH值5.0～10.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，而YP4和SM12在pH值10.0的培養(yǎng)中無法生長(zhǎng)，說明YP2具有更強(qiáng)的耐堿能力。

表4 分離株的生態(tài)適應(yīng)性

耐鹽能力測(cè)定結(jié)果表明，YP2、YP4和SM12均可耐受10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl，其中，YP2對(duì)鹽的耐受性最強(qiáng)，最高可耐受15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl，說明該菌株的耐鹽能力非常強(qiáng)。

2.4 鹽脅迫下接種分離株對(duì)燕麥生長(zhǎng)的影響

在鹽脅迫下接種3株分離株均能顯著(<0.05)提高燕麥株高和地上部鮮重(表5)，與對(duì)照組(CK)相比，接種YP2、YP4和SM12的燕麥株高分別增加72.02%、48.26%、68.39%，地上部鮮重分別增加186.11%、79.86%、138.89%。接種YP2、SM12的燕麥莖粗較CK分別顯著(<0.05)增加42.58%和28.23%。

表5 鹽脅迫下接種促生菌對(duì)燕麥生長(zhǎng)的影響

與CK相比，接種YP2、YP4、SM12促進(jìn)了燕麥根系的發(fā)育(圖1)，燕麥總根長(zhǎng)、根系總表面積、根尖數(shù)等均顯著(<0.05)增加，總根長(zhǎng)分別增加了392.35%、198.46%、262.65%，根系總表面積分別增加了378.07%、179.71%、218.50%，根尖數(shù)分別增加了518.85%、298.95%、312.65%。

A，CK；B，接種YP2；C，接種YP4；D，接種SM12。

總的來看，在鹽脅迫條件下接種YP2、YP4、SM12能促進(jìn)燕麥的生長(zhǎng)發(fā)育。

將燕麥的株高、莖粗、地上部鮮重、總根長(zhǎng)、根系總表面積、根尖數(shù)、根系直徑作為自變量，運(yùn)用主成分分析法綜合評(píng)價(jià)供試菌株的促生效果。主成分分析共提取到2個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率為98.676%，其中，第一主成分在株高、莖粗、地上部鮮重、總根長(zhǎng)、根系總表面積、根尖數(shù)上占有較大的載荷。根據(jù)綜合得分(表6)判斷，鹽脅迫下接種分離株對(duì)燕麥生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中，YP2的效果最好。

表6 分離株對(duì)燕麥的促生效果排名

接種YP2、YP4和SM12后，燕麥葉片的葉綠素、脯氨酸含量均顯著(<0.05)高于CK(表7)，其中，接種YP2的葉綠素、脯氨酸含量均最高，分別比CK增加312.20%、124.10%，說明接種分離株有助于提高鹽脅迫下燕麥葉片的光合活性，增強(qiáng)燕麥的抗鹽能力。

表7 鹽脅迫下接種分離株對(duì)燕麥生理特性的影響

接種YP2、YP4和SM12后，燕麥葉片的MDA含量均較CK顯著(<0.05)降低，且接種不同分離株的燕麥葉片MDA含量差異顯著(<0.05)，說明接種分離株可降低鹽脅迫對(duì)燕麥葉片膜系統(tǒng)的傷害程度。各處理中，接種YP2的燕麥葉片MDA含量最低，較CK降低43.34%。

接種YP2、YP4、SM12后，燕麥葉片的POD、CAT活性均顯著(<0.05)高于CK，其中，接種YP2的燕麥POD、CAT活性均最高，分別較CK升高274.09%和198.60%，說明在鹽脅迫下接種分離株可通過提高抗氧化酶的活性來增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的抗性。

2.5 分離株的菌種鑒定

以YP2的基因組為模板，27F、1492R為引物，擴(kuò)增到約1.4 kb的條帶。將其測(cè)序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(ID: MW 931715)，與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，下載與其同源性最高(一致性值在98%～100%)的菌株的序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示，該菌與彎曲芽孢桿菌()的親緣關(guān)系最近，認(rèn)為YP2可能為彎曲芽孢桿菌。

圖2 基于16S rDNA的YP2菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

鹽脅迫是導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受限的主要因子之一，多數(shù)根際促生菌很難適應(yīng)高鹽環(huán)境，因此目前開發(fā)研制的大部分生物菌劑在改良鹽堿土?xí)r效果不佳。篩選具有廣泛抗逆性的高效菌株、挖掘耐鹽促生菌種，是改良修復(fù)鹽堿地的重要途徑之一。芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，相比其他微生物更具開發(fā)優(yōu)勢(shì)。本研究從4種鹽生植物——鹽地堿蓬、鹽角草、蘆葦、水麥冬根際土中分離得到13株耐鹽堿芽孢桿菌，從中進(jìn)一步篩選到3株能耐受10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl高鹽環(huán)境，且有促生作用的菌株YP2、YP4、SM12，其中YP2在含有5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl環(huán)境下的IAA產(chǎn)量為62.1 mg·L，高于王丹等、張志東等篩選菌株的IAA產(chǎn)量(15.90、45.32 mg·L)，說明YP2具有較強(qiáng)的促生能力。經(jīng)形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列分析，初步鑒定YP2菌株為彎曲芽孢桿菌。

研究表明，向鹽堿土中接種耐鹽促生菌可提高植物的抗鹽性，對(duì)植物生長(zhǎng)具有明顯的促生作用。鹽脅迫環(huán)境下，接種劉佳莉等篩選的菌株A-4后，燕麥的株高、鮮重、根長(zhǎng)分別比對(duì)照組提高14.95%、 2.38%、24.56%。與其相比，本研究篩選的3株菌(YP2、YP4、SM12)在增加燕麥株高、地上部鮮重、促進(jìn)根系形態(tài)發(fā)育上的效果更好，其中，尤以接種YP2的效果最佳。推測(cè)分離株通過產(chǎn)生IAA、解磷、解鉀等促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)，提高根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，進(jìn)而促進(jìn)燕麥地上部的生長(zhǎng)，但其具體的促生機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

鹽脅迫下，植物光合作用強(qiáng)度降低，膜質(zhì)過氧化，活性氧平衡被破壞，生長(zhǎng)受阻，細(xì)胞生理功能受到破壞。植物促生菌在鹽脅迫下會(huì)通過誘導(dǎo)植物建立抵抗或忍耐機(jī)制，增強(qiáng)植物的抗鹽能力。武俊英等認(rèn)為，鹽脅迫下燕麥光合作用受阻，葉片葉綠素含量下降。本研究在鹽脅迫下接種分離株后，燕麥葉片的葉綠素含量顯著升高，MDA含量顯著下降，脯氨酸含量和抗氧化物酶的活性顯著上升，這與許多研究的結(jié)論一致，說明接種分離株可有效促進(jìn)葉片光合色素的合成，抑制葉片中活性氧的產(chǎn)生，從而減少氧化損傷，并通過脯氨酸的大量積累降低葉片細(xì)胞內(nèi)的水勢(shì)，減緩鹽脅迫引起的滲透脅迫。總的來看，在鹽脅迫條件下，接種分離株可有效緩解鹽脅迫對(duì)燕麥生長(zhǎng)的抑制，提高燕麥的耐鹽性。

綜上所述，本研究分離出的3株耐鹽促生芽孢桿菌，在鹽脅迫下均能顯著降低燕麥葉片中的MDA含量，提高葉綠素含量、脯氨酸含量，及POD、CAT活性，對(duì)燕麥生長(zhǎng)具有明顯的促生效果，尤其是YP2菌株的促生效果最好，可作為鹽堿地專用生物菌劑進(jìn)行開發(fā)。但是，關(guān)于這3株分離株對(duì)燕麥的促生機(jī)制等還有待進(jìn)一步深入探討，其在田間的實(shí)際應(yīng)用效果也還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。