不同調(diào)理劑組合對浙江紅壤土壤肥力、微生物群落多樣性和水稻產(chǎn)量的影響

朱 銘，劉 琛，林義成，郭 彬，李 華，傅慶林，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州310021)

當(dāng)前，我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨耕地資源不足的威脅。2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的耕地質(zhì)量報(bào)告顯示：全國中低產(chǎn)田面積為0.93億hm，占耕地總面積的68.89%，耕地質(zhì)量難以滿足當(dāng)前農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的需要。紅壤是我國南方的主要土壤類型之一，因存在土壤酸化和養(yǎng)分不均衡的問題，紅壤區(qū)的耕地大多數(shù)屬于中低產(chǎn)田。為響應(yīng)國家“藏糧于地、藏糧于技”戰(zhàn)略，快速提升紅壤生產(chǎn)能力已成為我國南方農(nóng)業(yè)發(fā)展研究的熱點(diǎn)問題之一。

楊永森等發(fā)現(xiàn)，在酸性土壤上施用石灰石粉能增加土壤的鹽基飽和度和可交換性陽離子，從而有效減緩?fù)寥浪峄?，且石灰石的粒徑越?xì)，起效越快。向土壤中施用腐殖酸能有效改良中低產(chǎn)田的土壤理化性狀，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而提升作物產(chǎn)量。王宇函等發(fā)現(xiàn)，向富鋁酸性紅壤施用腐殖酸，能夠緩解作物生長受到的鋁脅迫，增加作物產(chǎn)量，并改善作物的農(nóng)藝性狀。秸稈還田能加快土壤腐殖質(zhì)積累，進(jìn)一步促進(jìn)土壤腐殖酸的形成，提高土壤肥力和土壤微生物種群多樣性，促進(jìn)酶活性的增強(qiáng)和微生物的代謝活動(dòng)，從而促進(jìn)作物生長發(fā)育，增加產(chǎn)量，提高品質(zhì)。

綜上，施用土壤調(diào)理劑是一種十分有效的改土措施。但是，單一施用某一種土壤調(diào)理劑在短時(shí)間內(nèi)難以達(dá)到快速改良紅壤的目的，為取得理想的改良效果，需要配合施用多種土壤調(diào)理劑。盡管當(dāng)前關(guān)于單一調(diào)理劑的研究已十分廣泛、深入，但關(guān)于多種調(diào)理劑配合施用的研究還相對少見?；诖耍狙芯刻匾哉憬?nèi)的紅壤為試驗(yàn)對象，針對石灰石粉、秸稈和腐殖酸這3種土壤調(diào)理劑，探索不同組合對土壤肥力、微生物群落多樣性和水稻產(chǎn)量的影響，以期為紅壤地區(qū)稻田土壤的改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

蘭溪紅壤試驗(yàn)田于2015年建立，位于浙江省蘭溪市上華街道會(huì)橋村紅壤試驗(yàn)站(119°27′10.89″E，29°06′51.38″N)，海拔25～60 m，坡度8°，土壤系由第四紀(jì)紅色黏土發(fā)育而成的水稻土。當(dāng)?shù)貙賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，光照適宜，溫暖濕潤，降水充足，雨熱同期，年均降水量1 353 mm，年均蒸發(fā)量1 512 mm，年日照時(shí)數(shù)1 850～2 015 h，年無霜期283 d，最高氣溫41.3 ℃，最低氣溫-8.6 ℃，年均氣溫17.7 ℃。

供試紅壤0～20 cm土層的基本理化性狀如下：pH值5.18，有機(jī)質(zhì)(OM)29.60 g·kg，全氮(TN)1.99 g·kg，堿解氮(AN)154.44 mg·kg，全磷(TP)0.07 g·kg，有效磷(AP)5.18 mg·kg，全鉀(TK)6.53 g·kg，速效鉀(AK)97.26 mg·kg，陽離子交換量(CEC)18.84 cmol·kg。

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理：CK，不施肥且不施調(diào)理劑；N，常規(guī)施肥；NS，常規(guī)施肥+石灰石粉；NSJ，常規(guī)施肥+石灰石粉+秸稈還田；NSF，常規(guī)施肥+石灰石粉+腐殖酸。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)，隨機(jī)排列，每個(gè)小區(qū)面積50 m(10 m×5 m)。

各處理中，常規(guī)施肥的施用量為N 180 kg·hm、PO90 kg·hm、KO 120 kg·hm，供試氮肥為尿素(N 46%，中鹽安徽紅四方肥業(yè)股份有限公司)，磷肥為鈣鎂磷肥(PO12%，荊門市高園磷肥有限公司)，鉀肥為氯化鉀(KO 60%，中化化肥有限公司)。磷肥和鉀肥做基肥一次性施入，氮肥按基肥、追肥1∶1的比例施入。

石灰石粉來源于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，含CaCO95.00%、AlO0.72%、FeO0.14%，pH值9.10，施用量為3 750 kg·hm，施用前，將石灰石粉碎并過2.36 mm篩。秸稈系上一季收割后的稻草秸稈，pH值7.51，有機(jī)碳392.46 g·kg，全氮8.75 g·kg，全磷0.28 g·kg，全鉀1.91 g·kg，施用量為3 750 kg·hm，施用前，將秸稈粉碎至長度為2～5 cm的小段，施用時(shí)，一次性施入田塊并翻耕。腐殖酸來源于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，有機(jī)質(zhì)486.83 g·kg，全氮6.10 g·kg，全磷3.06 g·kg，全鉀4.51 g·kg，施用量為1 500 kg·hm，施用前，將腐殖酸粉碎并過2.36 mm篩。

實(shí)際操作中，先于2019年3月4日一次性向試驗(yàn)田內(nèi)按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)施入石灰石粉，隨后于2019年3月22日按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)施入基肥和腐殖酸，秸稈還田后一同進(jìn)行翻耕，耕深20 cm。水稻于4月25日播種，5月17日移栽，5月27日追肥，8月23日收獲。于水稻分蘗末期烤田，在孕穗期和成熟期進(jìn)行濕潤和落干。全生育期各處理的稻田管理措施一致，供試水稻品種為浙優(yōu)18。

1.2 土壤樣品采集

土壤采樣時(shí)間為2019年8月16日(水稻收割前7 d)，采樣方式為S形取樣法隨機(jī)布點(diǎn)。用取土器挖取耕層(0～20 cm)土壤樣品進(jìn)行分析，挖取時(shí)先去除表層植株根系和破碎變形的土壤，用環(huán)刀盒將剩余土壤帶回，以確保土壤結(jié)構(gòu)完整自然。帶回實(shí)驗(yàn)室后，將土樣混合均勻分成3份：一份風(fēng)干，用于測定土壤基本理化性狀；一份于4 ℃保存，用于測定土壤微生物指標(biāo)；另一份凍干后在-80 ℃保存，用于土壤微生物分子生物學(xué)分析。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤基本理化性狀

參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》，測定土壤基本理化性狀：pH值采用玻璃電極法測定，所用儀器為賽多利斯PB-30L型酸度計(jì)(德國Sartorius)；有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量-外加熱法測定；全氮含量采用濃硫酸催化消煮-凱氏定氮法測定，所用儀器為KDN-04A型凱氏定氮儀[樂迪儀器(寧波)有限公司]；堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測定；有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，所用儀器為930F型熒光分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；速效鉀含量采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定，所用儀器為6400A型火焰光度計(jì)(上海忻一精密儀器有限公司)。

1.3.2 土壤微生物AWCD值

采用Biolog法測定土壤微生物AWCD值，以反映土壤微生物活性和群落功能多樣性。試驗(yàn)材料選用美國Biolog公司生產(chǎn)的ECO板，搭配使用美國Biolog公司生產(chǎn)的Biolog Micro Station Ⅲ全自動(dòng)微生物鑒定儀。用0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉溶液從土壤中提取微生物，并將浸提液稀釋1 000倍接種到ECO板中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192 h，在590 nm和750 nm條件下測定AWCD值。

1.3.3 土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFA)

采用Bligh等的方法，以甲酯19∶0為內(nèi)標(biāo)，用土壤浸提劑(氯仿、甲醇、磷酸緩沖液按1∶2∶0.8的體積比混合)提取脂類，經(jīng)500 mg Sep-pak C18固相萃取小柱(美國Waters)層析分離，收集甲醇洗脫液進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，用Agilent 6890型氣相色譜儀(美國Agilent)測定，并借助MIDI Sherlock MIS 4.5 微生物鑒定系統(tǒng)對得到的PLFA圖譜進(jìn)行脂肪酸成分鑒定。其中，脂肪酸15:0、17:0、i15:0、i16:0、i17:0、a15:0、a17:0、16:1w7c、18:1w7c、cy17:0和cy19:0用于指示細(xì)菌PLFA，18:2w6，9c用于指示真菌PLFA。

1.3.4 高通量測序

將凍干的土壤樣品送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行16S rDNA高通量測序。稱取0.5 g以上的土樣，5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共15個(gè)樣品。使用Illumina MiSeq測序方法對16s rDNA的單V區(qū)(V3、V4)進(jìn)行高通量測序。

1.3.5 水稻產(chǎn)量構(gòu)成

水稻成熟后，每小區(qū)全部實(shí)收測產(chǎn)，待籽粒曬干后計(jì)算產(chǎn)量。同時(shí)每小區(qū)隨機(jī)選取20株水稻進(jìn)行考種，測定水稻的穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等產(chǎn)量構(gòu)成指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)。利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，對有顯著(<0.05)差異的，采用Tukey法進(jìn)行多重比較。采用Canoco 5.0軟件對微生物群落數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)，采用average方法對微生物群落數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類，以等級樹的形式展示樣本間的相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 對土壤基本理化性狀的影響

NS、NSJ和NSF這3個(gè)處理施用的調(diào)理劑中均有石灰石粉，在種植一季水稻后，土壤表層pH值均較CK和N處理顯著(<0.05)增加(表1)，從CK的5.18上升到6.35～6.78。這表明施用石灰石粉能夠改善紅壤的酸化問題，降低土壤酸性。與CK和N處理相比，土壤有機(jī)質(zhì)含量僅在NSF處理下顯著(<0.05)提高，說明添加腐殖酸有助于土壤有機(jī)質(zhì)的積累。土壤全氮和堿解氮含量在各處理間均無顯著差異。與CK相比，N、NSJ和NSF處理的土壤有效磷含量均顯著(<0.05)提高；但與N相比，NS、NSJ和NSF處理的土壤有效磷含量均無顯著差異，說明肥料的施用有助于土壤有效磷含量的提高。此外，NSJ和NSF的土壤有效磷含量均顯著(<0.05)高于NS處理，推測是由于NS處理只施石灰石粉，可能對土壤中的磷產(chǎn)生了固定作用，而腐殖酸或秸稈的添加有助于抵消這一負(fù)向效應(yīng)。NSJ、NSF處理的土壤速效鉀含量顯著(<0.05)高于N、CK，說明秸稈還田和腐殖酸的添加有助于土壤速效鉀含量的提升，其中，NSJ處理的土壤速效鉀含量較NS處理顯著(<0.05)提高了9.68%。

表1 不同處理對紅壤基本理化性狀的影響

2.2 對土壤微生物群落的影響

2.2.1 群落活性

不同處理對土壤微生物群落活性有明顯影響(圖1)?？偟膩砜矗魈幚淼腁WCD值均在前120 h快速升高，呈指數(shù)生長趨勢，之后趨于平穩(wěn)。從不同時(shí)間點(diǎn)各處理的AWCD值判斷，土壤微生物群落活性由高到低始終保持NSF>NSJ>NS>N>CK的次序。NSF和NSJ處理的土壤微生物群落活性在各時(shí)間點(diǎn)均比較相近，且均顯著(<0.05)高于CK；NS與N處理的土壤微生物活性在各時(shí)間點(diǎn)也均比較接近，且同樣顯著(<0.05)高于CK。

圖1 不同處理下土壤微生物群落的AWCD值

2.2.2 碳源利用能力

對不同處理下土壤微生物對31種碳源的利用能力做主成分分析(圖2)，結(jié)果顯示：第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為20.08%和16.03%，累積方差貢獻(xiàn)率為36.11%。不同處理下，土壤微生物在碳源利用上有明顯的空間分異特征，說明其在生理代謝上存在明顯不同。從PC1看，CK、N處理與NS、NSJ、NSF處理沿PC1軸明顯分開，說明NS、NSJ與NSF處理的土壤微生物對碳源的利用較為相似，且與CK、N處理存在差異；從PC2看，在PC2軸上，NSJ與NSF的碳源利用特征比較相似，均分布在正方向上，而CK、N和NS處理的碳源利用特征比較相似，均分布在負(fù)方向上。

圖2 不同處理下土壤微生物碳源利用能力的主成分分析

2.2.3 群落結(jié)構(gòu)

與CK相比，施肥和不同調(diào)理劑的施入均能顯著(<0.05)增加土壤總PLFA含量、細(xì)菌PLFA含量、革蘭氏陰性菌PLFA含量和革蘭氏陽性菌PLFA含量(表2)，且NS、NSJ與NSF處理的上述指標(biāo)還均顯著(<0.05)高于N處理，其中，NSF處理的總PLFA含量最高。但是，各處理的土壤真菌PLFA含量沒有顯著差異。總的來看，秸稈還田，施用腐殖酸、石灰石粉均能增加土壤細(xì)菌豐度，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

表2 不同處理下土壤微生物的磷脂脂肪酸(PLFA)含量

對不同處理下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)做主成分分析(圖3)，結(jié)果顯示：PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為47.20%和17.62%，累積方差貢獻(xiàn)率為64.82%，說明二者可以共同解釋64.82%的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化。不同處理下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的空間分異特征。從PC1看，NS、NSJ和NSF處理的群落結(jié)構(gòu)比較相似，均分布在PC1軸的正方向；CK和N處理的群落結(jié)構(gòu)比較相似，均分布在PC1軸的負(fù)方向。從PC2看，NSF處理均分布在PC2軸的正方向，CK處理均分布在PC2軸的負(fù)方向，這兩者的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)間存在較大差異。

圖3 不同處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析

2.2.4 群落組成

取土壤樣品的優(yōu)質(zhì)序列隨機(jī)抽平到最低樣本序列量的95%后進(jìn)行后續(xù)分析，檢測到的土壤細(xì)菌類群主要分布于11個(gè)細(xì)菌門(圖4)，其中，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)在各處理下均是優(yōu)勢菌門，合計(jì)約占細(xì)菌群落總豐度的75%。與CK、N處理相比，NS、NSJ和NSF處理提高了變形菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度。與NS處理相比，NSJ處理的變形菌門相對豐度增加，NSF處理的擬桿菌門相對豐度增加。與CK相比，NS和NSJ處理的綠彎菌門相對豐度降低，但NSF處理下并無顯著變化。

圖4 不同處理下土壤細(xì)菌門水平上的相對豐度

從不同處理下土壤細(xì)菌群落(門水平上)的多樣性指標(biāo)(圖5)判斷：NS處理的Chao1指數(shù)顯著(<0.05)高于其他處理；NS處理的Observed species指數(shù)顯著(<0.05)高于CK、N和NSF處理，但與NSJ處理無顯著差異；NS和NSJ處理在Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)上無顯著差異，但均顯著(<0.05)高于其他處理。

圖5 不同處理下土壤微生物的Alpha多樣性指數(shù)

對不同處理下的土壤微生物群落組成(門水平上)進(jìn)行主成分分析(圖6)，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為20.3%和12.8%。在PC1上，NS、NSJ和NSF處理明顯地與CK和N處理區(qū)分開；在PC2上，NSF處理明顯地與其他處理區(qū)分開。

圖6 不同處理下土壤微生物群落組成的主成分分析

對不同處理下土壤微生物群落組成的Beta多樣性進(jìn)行聚類(圖7)，NSJ處理獨(dú)成一簇，NSF處理在大分支下處于第二層級，NS處理處于下一層級，N處理與CK處理處于第4層級。這表明，調(diào)理劑的施用改變了土壤微生物群落的Beta多樣性。

CK-1、CK-2、CK-3分別為CK處理的3個(gè)重復(fù)。其他依此類推。

2.3 對水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

總的來看，不同處理對水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響主要集中在穗數(shù)和產(chǎn)量2個(gè)指標(biāo)上(表3)。在水稻產(chǎn)量方面，相較于CK和N處理，調(diào)理劑的施用顯著(<0.05)增加了水稻產(chǎn)量，與CK相比，增幅在7.10%～11.02%，其中，NSF處理的水稻產(chǎn)量還顯著(<0.05)高于NS。

表3 不同處理對水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

3 討論

本研究顯示，調(diào)理劑的使用改善了紅壤的理化性質(zhì)和微生物活性。一般來說，石灰石粉的施用能迅速提升土壤pH值，降低土壤酸性；秸稈還田有助于增強(qiáng)土壤微生物群落的生物量和群落活性，但效果滯后，這可能與秸稈分解腐化緩慢有關(guān)；而腐殖酸能較為迅速地增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，促進(jìn)微生物的生長代謝，增強(qiáng)土壤微生物活性。在本研究中，調(diào)理劑的使用改變了紅壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。Biolog試驗(yàn)結(jié)果表明，石灰石粉、秸稈和腐殖酸的施用能提高土壤微生物活性，增強(qiáng)微生物群落利用碳源的能力。Howell等、MacDonald等的研究也得到類似結(jié)果。從AWCD值判斷，調(diào)理劑的添加使得土壤微生物群落的代謝功能大大增強(qiáng)，碳素在微生物與土壤之間的循環(huán)更加活躍。在144 h的試驗(yàn)過程中，CK處理的AWCD值始終最低，而NSJ與NSF處理的AWCD值相較于N與NS處理升高得更加迅速，這可能與秸稈和腐殖酸等有機(jī)物料的添加為微生物的生長提供了充足的碳源養(yǎng)分有關(guān)。磷脂脂肪酸的測定結(jié)果表明：石灰石粉、秸稈和腐殖酸的施用增加了土壤總PLFA含量、細(xì)菌PLFA含量、革蘭氏陰性菌PLFA含量和革蘭氏陽性菌PLFA含量，這與Xiang等的研究結(jié)果相似?？赡苁且?yàn)槲⑸锶郝涞慕M成、利用碳源的能力和功能均會(huì)受到土壤酸堿性和養(yǎng)分有效性的影響。秸稈和腐殖酸等有機(jī)物料的加入會(huì)釋放大量的養(yǎng)分和碳源，使土壤中的營養(yǎng)元素得到補(bǔ)充，從而使得微生物的生物量增加，活性增強(qiáng)。Peng等和李濤等的研究均支持上述觀點(diǎn)。另外，土壤高通量測序的結(jié)果表明：施用石灰石粉提高了土壤中變形菌門和擬桿菌門的相對豐度，秸稈還田提高了變形菌門的相對豐度，而腐殖酸的施用提高了擬桿菌門的相對豐度。

本研究中，高通量測序與PLFA的結(jié)果可以相互驗(yàn)證。PLFA的結(jié)果顯示，調(diào)理劑的施用改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，而高通量測序的結(jié)果更加具體地揭示了微生物群落結(jié)構(gòu)的具體變化。高通量測序中群落多樣性指數(shù)的升高也驗(yàn)證了Biolog試驗(yàn)中AWCD值變大的結(jié)果。高通量測序揭示：石灰石粉的施用提高了Chao1和Observed species指數(shù)，增強(qiáng)了群落豐富度；秸稈還田和石灰粉的施用有助于提高Shannon和Simpson指數(shù)，增強(qiáng)群落多樣性。另外，高通量測序與PLFA的主成分分析結(jié)果具有一致性：CK與N處理的區(qū)分不明顯，說明常規(guī)施肥并不會(huì)在碳源代謝和微生物群落結(jié)構(gòu)上造成較大影響；而NSF與其他4個(gè)處理區(qū)分明顯，說明在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上配施石灰石粉和腐殖酸會(huì)極大地影響土壤微生物群落的演替。

本研究還發(fā)現(xiàn)，調(diào)理劑的使用顯著提高了水稻產(chǎn)量。這可能是由于石灰石粉緩解了紅壤的酸化，從而更有利于水稻的生長發(fā)育。石灰石粉、秸稈和腐殖酸的施用均能顯著提高試驗(yàn)條件下的水稻產(chǎn)量，其中以NSF處理對產(chǎn)量的提升效果最佳。

綜上，NSF處理通過克服紅壤在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中存在的限制性障礙因子提升了土壤肥力，提高了土壤微生物群落豐富度和多樣性，并最終增加了水稻產(chǎn)量。綜合來看，在試驗(yàn)條件下，常規(guī)施肥+石灰石粉+腐殖酸是改良紅壤、提高水稻產(chǎn)量的最佳組合。