甜菊糖苷單體制備研究進(jìn)展

趙聰敏，呼念念，江利華

（河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院邯鄲市天然產(chǎn)物與功能食品開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 邯鄲 056107）

甜菊糖是從甜葉菊中提取分離得到的一種天然、保健的新型甜味劑，具有熱量低、甜度高等特點(diǎn)，甜度是蔗糖的250倍～300倍，無(wú)毒，無(wú)副作用[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗炎，預(yù)防齲齒、肥胖癥、糖尿病，降壓、降血脂及降血糖等作用，發(fā)展前景廣闊[2-10]。甜菊糖含有糖苷類、生物堿、黃酮類等營(yíng)養(yǎng)成分，甜菊糖苷占絕大部分，甜菊糖苷由多種單體化合物組成，每種單體各具特色。例如萊鮑迪苷A（rebaudioside A，RA）、萊鮑迪苷D（rebaudioside D，RD）和萊鮑迪苷M（rebaudioside M，RM）等單體甜度高、口感較佳，可將其單獨(dú)添加到糕點(diǎn)、糖果、飲料中，直接作為一種甜味劑使用[11-14]；甜菊雙糖苷具有降血糖、抗結(jié)核等生理功能，可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域；萊鮑迪苷 A、甜菊雙糖苷（steviolbioside，SX）作為中間體衍生化成某種生理活性更突出的化合物[15]。但是甜菊糖苷只有萊鮑迪苷A和甜菊苷（stevioside，STV）單體含量較高，其他單體含量極低；而且單體之間性質(zhì)差異不顯著使得甜菊糖苷單體分離制備存在一定困難[16]。本文綜述了甜菊糖苷單體制備的方法，以期優(yōu)化制備高純度低成本甜菊糖苷產(chǎn)品的工藝路線，為實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷各單體工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 甜菊糖結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

甜菊糖是從甜葉菊中提取分離得到一類糖苷物質(zhì)，甜菊糖苷占甜菊糖的80%以上，目前常見(jiàn)有13種糖苷，具體的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)見(jiàn)圖1和表1[17]。

圖1 甜菊糖苷結(jié)構(gòu)通式Fig.1 General structure of stevia glycoside

表1 13種糖苷的化合物名稱、R1位取代基和R2位取代基Table 1 Compound names,R1and R2substituents of 13 stevia glycosides

2 甜菊糖苷單體的制備方法

2.1 提取法

2.1.1 樹脂法與重結(jié)晶法

樹脂法與重結(jié)晶法是單體制備備受青睞的途徑，工業(yè)生產(chǎn)上普遍使用樹脂法結(jié)合重結(jié)晶法來(lái)分離制備萊鮑迪苷A[18]，采用樹脂法與重結(jié)晶法制備其他甜菊糖苷單體也有報(bào)道。

一般采用 D107、D108、LX-T28、LX-T81 等傳統(tǒng)大孔吸附樹脂結(jié)合重結(jié)晶法制備高純度萊鮑迪苷A和甜菊苷。但因甜菊糖苷各單體結(jié)構(gòu)較為接近，上述這些樹脂在制備甜菊糖苷單體時(shí)吸附容量與選擇性不能同時(shí)兼?zhèn)?，只能分離制備含量較多的組分，很難得到其他單體。慕峰等[19]研發(fā)了一種高交聯(lián)、帶有大量弱極性酯基的新型大孔吸附樹脂，以甜菊糖粗提物為原料，在上樣量14 BV，以30%乙醇作為洗脫劑的工藝條件下制備得到了純度大于20%、得率大于70%的萊鮑迪苷D，實(shí)現(xiàn)了萊鮑迪苷D的部分富集，克服了傳統(tǒng)樹脂不能兼?zhèn)淞己玫奈叫院瓦x擇性的缺陷；但得到的單體純度低，需要進(jìn)一步提高提純能力。文獻(xiàn)[20]提到以甜菊糖結(jié)晶母液干粉為原料，通過(guò)多次重結(jié)晶去掉甜菊糖結(jié)晶母液中的萊鮑迪苷A，然后以MN-100大孔吸附樹脂，乙醇水作為洗脫劑，通過(guò)乙醇水重結(jié)晶，使萊鮑迪苷D單體純度、產(chǎn)率分別達(dá)95%、70%以上，實(shí)現(xiàn)了萊鮑迪苷D的高富集。

利用樹脂法與重結(jié)晶法可以大量制備甜菊糖含量較多的單體萊鮑迪苷A、甜菊苷，提純能力較強(qiáng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)；但對(duì)于含量較少的單體來(lái)說(shuō)，操作工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高、制備分離難度大、分離效果較差，甜菊糖苷單體純度達(dá)到98%以上比較困難。

2.1.2 色譜法

色譜法又稱柱層析法，主要有吸附柱層析、凝膠柱層析、制備層析等方法，其中制備層析法即制備型色譜法是目前甜菊糖單體制備常用的色譜法，該法是基于分析性高效液相的原理，利用流動(dòng)相中的各組分與固定相發(fā)生相互作用力的差異，達(dá)到分離純化的目的[21]。

張立鵬等[22]以C18作為色譜柱填料，分別以70%甲醇水和90%甲醇水作流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)高壓制備型液相色譜兩次分離純化，得到萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C（rebaudioside C，RC）、甜菊苷及甜菊雙糖苷單體，這5種單體純度均大于90%；然后通過(guò)甲醇重結(jié)晶，使這5種單體純度均大于98%。

張凌云等[23]采用中壓制備色譜儀，以改性羧基填料填充色譜柱，80%乙腈水作為流動(dòng)相，進(jìn)樣濃度為280 mg/mL，進(jìn)樣體積為0.4 mL，流速為4 mL/min，在此條件下分離甜菊糖結(jié)晶母液萊鮑迪苷A，最終得到純度為90.22%、得率為79%萊鮑迪苷A。

色譜法可制備毫克級(jí)別甚至克級(jí)別的高純度甜菊糖苷單體，但流程繁瑣、溶劑消耗量大、價(jià)格優(yōu)勢(shì)差、產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求；而且讓較難分離的甜菊糖苷單體純度達(dá)到95%以上，需要與其他方法相結(jié)合使用。

2.2 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是以簡(jiǎn)單、易得的物質(zhì)作為起始原料，通過(guò)水解反應(yīng)、取代反應(yīng)、置換反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，生成其他復(fù)雜物質(zhì)的過(guò)程。

Wen等[24-25]以甜菊糖苷為起始原料，研究萊鮑迪苷R（rebaudioside R，RR）和萊鮑迪苷S（rebaudioside S，RS）的化學(xué)合成，采用了線性和匯聚式方式完成了萊鮑迪苷R的合成，采用模塊化合成策略成功制得高含量萊鮑迪苷S。

文獻(xiàn)[26]指出，以萊鮑迪苷C作為底物，萊鮑迪苷C與R3化合物（見(jiàn)圖2）在碳酸銀的作用下，于30℃～100℃下發(fā)生取代反應(yīng)，該反應(yīng)持續(xù)12 h～24 h，得到合成萊鮑迪苷M的中間體；隨后萊鮑迪苷M的中間體在碳酸鉀的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，然后調(diào)整溶液pH值，再經(jīng)乙醇水重結(jié)晶，實(shí)現(xiàn)了萊鮑迪苷C高效合成萊鮑迪苷M。

圖2 R3化合物Fig.2 R3compounds

因原料廉價(jià)易得、反應(yīng)條件溫和、操作工藝簡(jiǎn)便、生產(chǎn)方便快速、投資少，化學(xué)合成法成為甜菊糖苷單體制備的重要的手段之一。但是利用化學(xué)法合成甜菊糖苷的研究較少，該法對(duì)合成甜菊糖的研究停留在試驗(yàn)階段，相關(guān)策略體系不完備不成熟。

2.3 生物合成與轉(zhuǎn)化法

2.3.1 生物合成

甜菊糖的生物合成一般是指植物體內(nèi)最初的物質(zhì)，通過(guò)甲基赤蘚糖醇途徑逐步合成異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），在一系列酶的作用下轉(zhuǎn)化成甜菊醇；之后甜菊醇在各類UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyltransferase，UGTs）作用下合成其他衍生物[27]。

文獻(xiàn)[28]指出通過(guò)甲基赤蘚糖酵途徑，丙酮酸和甘油醛-3-磷酸在各種酶的作用下，一步步催化縮合成牻牛兒牻牛兒焦磷酸（geranium geranium pyrophosphate，GGPP）；然后在 SrCPPS、SrKS、SrKO 和 SrKAH等幾種酶基因作用下，牻牛兒牻牛兒焦磷酸轉(zhuǎn)化為甜菊醇；隨后甜菊醇在UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyltransferase，UGTs） 基因 SrUGT85C2、SrUGT74G1 和SrUGT76G1的作用下經(jīng)過(guò)一系列糖基化形成甜菊苷和萊鮑迪苷A。

在甜菊糖苷生物合成途徑中以UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基化反應(yīng)過(guò)程中所需的糖基供體尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）價(jià)格高昂，成本高，工業(yè)化可行性低，需要完善UDPG的供給策略或者找尋UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的替代品。由于擬南芥蔗糖合成酶SUS1可以構(gòu)建糖基供體尿苷二磷酸葡萄糖再生循環(huán)利用體系，唐小雁等[29]在探索以甜菊苷作為底物合成萊鮑迪苷A的過(guò)程中，通過(guò)將UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合成酶兩步催化反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建重組酵母工程菌GS115/pPIC9K-UGT/pPICZA-At－SUS，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組酶，形成雙酶共表達(dá)體系；在此基礎(chǔ)上對(duì)催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了較佳反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)了更高效催化甜菊苷合成萊鮑迪苷A，使工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。王婉潔等[30]在探索以萊鮑迪苷A作為底物合成萊鮑迪苷D的過(guò)程中，考慮用其他類型的酶取代UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，探索了葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶和交替糖蔗糖酶的催化效果，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于嗜檸檬酸明串珠菌L.citreum CICC23234的交替糖蔗糖酶可以將萊鮑迪苷A更有效地催化合成萊鮑迪苷D的同分異構(gòu)體，并經(jīng)過(guò)甜味特性研究發(fā)現(xiàn)，該法得到的萊鮑迪苷D的同分異構(gòu)體，溶解度較高，味感較好。

采用生物合成還實(shí)現(xiàn)了萊鮑迪苷E（rebaudioside E，RE）催化合成萊鮑迪苷D[31]，甜菊苷E催化合成萊鮑迪苷M[32]。

2.3.2 生物轉(zhuǎn)化

甜菊糖苷的生物轉(zhuǎn)化一般是指利用生物或酶將單糖或寡糖長(zhǎng)鏈引入到甜菊糖苷配基的C13和C19位活潑氫或者糖基部位的羥基上形成新的化合物[27]。

楊鳳平[33]在腐生葡萄球菌（Staphylococcus saparophyticus）、梧青霉（Penicillium citrinum）、木霉（Trichoderma spp）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、嗜松青霉（Penicillium pinophilum CGMCC NO.6366）、冠突散囊菌（Eurotium cristatum）這6種菌株中篩選發(fā)現(xiàn)嗜松青霉可以將甜菊糖苷含有的甜菊苷轉(zhuǎn)化成甜茶苷（rubusoside，RUB）、萊鮑迪苷C轉(zhuǎn)化成杜克苷A（dulcoside A，DA），不會(huì)轉(zhuǎn)化萊鮑迪苷A；同時(shí)探索以嗜松青霉對(duì)轉(zhuǎn)化甜菊糖苷效果的影響因素時(shí)，發(fā)現(xiàn)在甜菊糖苷底物濃度為2%、pH5、溫度為55℃，使用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜松青霉孢子階段產(chǎn)生的酶轉(zhuǎn)化作用較強(qiáng)、效率較高，此時(shí)甜菊苷轉(zhuǎn)化率為91.8%、甜茶苷產(chǎn)率為73.23%，萊鮑迪苷C轉(zhuǎn)化率為55.63%，杜克苷A產(chǎn)率為34.57%。然后以乙醇水作洗脫劑，分別使用聚酰胺與AB-8大孔樹脂對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，甜茶苷純度為91.30%、杜克苷A純度為83.15%。

文獻(xiàn)[34]指出利用大腸桿菌 K-12（E.coli K-12）轉(zhuǎn)基因菌株產(chǎn)生的兩種UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和一種蔗糖合成酶，將甜菊苷或者萊鮑迪苷A轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷AM（rebaudioside AM，RAM），并經(jīng)過(guò)歐洲食品安全管理局（European Food Safety Authority，EFSA）對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)后，允許萊鮑迪苷AM正式作為一種甜味劑使用。

采用生物轉(zhuǎn)化法還成功實(shí)現(xiàn)了從萊鮑迪苷E轉(zhuǎn)化成萊鮑迪苷M[35]。并且從萊鮑迪苷A到萊鮑迪苷D的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中分離得到萊鮑迪苷D的同分異構(gòu)體萊鮑迪苷D2[36]和萊鮑迪苷M的同分異構(gòu)體萊鮑迪苷M2兩個(gè)次要產(chǎn)物[37]。

因高效可控、選擇性高、安全方便等優(yōu)勢(shì)，生物合成與轉(zhuǎn)化成為成為甜菊糖苷單體制備常規(guī)的途徑之一。但生物合成和轉(zhuǎn)化法通常使用的酶成本高，制備的單體純度較低、缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，導(dǎo)致該法在甜菊糖單體制備的應(yīng)用受到了極大的限制。

3 結(jié)論

對(duì)于甜菊糖苷單體中萊鮑迪苷A和甜菊苷單體制備研究頗多，工業(yè)化生產(chǎn)相對(duì)成熟；其他甜菊糖苷單體制備研究較少，僅限于實(shí)驗(yàn)室研究或者工業(yè)化生產(chǎn)處于起步階段。目前從整體來(lái)看甜菊糖苷單體制備體系方法尚未成熟，工業(yè)化生產(chǎn)可行性低，缺少一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此在研究生產(chǎn)過(guò)程中如何革新傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，打破技術(shù)壁壘，形成完備的體系方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷單體高效分離與高效制備以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要是目前研究的熱點(diǎn)，也是需要重點(diǎn)攻克的難點(diǎn)之一。