基于Illunima Miseq測序技術(shù)的黃酒麥曲真菌多樣性分析

席啦，孔祥聰，楊少勇，劉忠軍，郭壯，趙慧君*

（1.湖北文理學(xué)院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100）

黃酒是中國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵酒精飲料，已有數(shù)千年的歷史[1]。與日本酒曲相似，麥曲是黃酒釀造過程中最重要的原料之一，其首先將小麥研磨成粉并添加適量的水制成不同大小的磚塊，隨后在室溫（28℃～30℃）下培養(yǎng)48 h，最后于45℃干燥直至水分含量低于12%（質(zhì)量比）[2]。在麥曲的制作過程中，會混入各種微生物，包括霉菌和酵母菌等[3]，同時麥曲在發(fā)酵過程中，由于微生物的生長代謝，產(chǎn)生了不同含量的高級醇、脂肪酸、醛、酯、酚和酮等化合物[4]，這些都極大地影響了黃酒的風(fēng)味。為進一步了解黃酒風(fēng)味的形成因素，有必要對麥曲中的微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析。

與傳統(tǒng)微生物學(xué)手段相比，分子生物學(xué)技術(shù)可以更好地解析微生物的組成和多樣性，并為環(huán)境微生物的研究提供新的視角[5]。近年來，隨著測序技術(shù)的迅速發(fā)展和測序成本的快速下降，以Illumina Miseq為代表的第二代測序技術(shù)在解析環(huán)境微生物多樣性中發(fā)揮著重要的作用，其具有檢測快速、通量高和靈敏度高等優(yōu)點[6]，不僅廣泛應(yīng)用于土壤檢測[7]、腸道微生物菌群解析[8]和水質(zhì)分析[9]等，在解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物結(jié)構(gòu)等方面亦有較多的應(yīng)用，如酸菜[10]、酸奶[11]、米酒[12]、香腸[13]和豆豉[14]等。

本研究利用Illumina Miseq測序技術(shù)對黃酒麥曲中真菌的群落結(jié)構(gòu)進行了分析，同時結(jié)合多元統(tǒng)計學(xué)手段對真菌多樣性進行了進一步的解析，以獲得麥曲真菌的群落特征，以期為后期黃酒的發(fā)酵以及黃酒的風(fēng)味改良提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熟麥曲：采集自浙江省麗水市，編號分別為MQ1、MQ2、MQ3 和 MQ4。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒：德國QIAGEN 公司；2×PCR mix、rTaq、dNTP mix 和 DL2000 DNA Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物SSU0817F、SSU1196R：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VeritiTM96孔Thermal cycler PCR儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；NanoDrop 2000/2000c：美國Thermo Fisher公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；FC2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；Illunima Miseq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務(wù)器：美國DELL公司；HR40-IIB2生物安全柜：海爾集團電子商務(wù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品宏基因組提取與檢測

依照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒所提供的方法對麥曲樣品中微生物宏基因組DNA進行提取，使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對其完整度進行檢測，使用NanoDrop對其濃度進行評估，并將檢驗合格的DNA置于-40℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 麥曲真菌18S rRNA聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增及 Illunima Miseq 高通量測序

參考王丹丹等[15]的方法進行麥曲樣品真菌18SrRNA PCR擴增及Illunima Miseq高通量測序。其中PCR擴增體系為20 μL的體積，分別為5×PCR緩沖液4 μL，dNTP mix 2 μL，正向引物 SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'，加入7個核苷酸通用標簽）和反向引物SSU1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）各0.8μL，rTaq酶0.4μL，DNA模板10ng，ddH2O 補至 20 μL。PCR 擴增程序：95℃ 3 min，95℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共 30 次循環(huán)，72 ℃ 10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，檢測合格后將PCR產(chǎn)物稀釋在同一濃度（100 nmol/L）進行Illunima Miseq高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參照王玉榮等[16]的質(zhì)控條件對高通量下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制和拼接。參照郭壯等[17]的分析方法，基于QIIME分析平臺對麥曲樣品中的真菌構(gòu)成和多樣性進行了分析。具體分析流程如下：1）使用PyNAST軟件對序列進行校準和排齊；2）分別在100%和97%相似性下進行序列歸并構(gòu)建分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）；3）使用 ChimeraSlayer軟件識別并刪除含有嵌合體的OTU序列；4）基于UNITE數(shù)據(jù)庫進行代表性序列的同源性比對；5）分別對麥曲樣本中真菌微生物的α和β多樣性進行解析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于Office 2019軟件對各項數(shù)據(jù)進行整理和分析；通過Origin 8.5軟件進行柱狀圖的繪制；通過Bio Edit軟件和MEGA 7.0軟件繪制核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹；通過Matlab 2010b軟件進行熱圖的可視化；基于在線 網(wǎng) 站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制 Venn 圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列多樣性與豐富度

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對采集的4個黃酒麥曲樣品中真菌多樣性進行解析，18S rRNA測序結(jié)果及各分類學(xué)地位數(shù)量信息如表1所示。

表1 黃酒麥曲樣品多樣性指數(shù)Table 1 The diversity indexs of wheat Qu for yellow wine

由表1可知，本研究4個黃酒麥曲樣品共產(chǎn)生138 769條高質(zhì)量的18S rRNA序列，平均每個樣品34 692條序列。首先采用100%相似度對序列進行劃分，共獲得40 135條無重復(fù)序列集，在采用97%相似度建立操作分類單元，共獲得4 558個OTU，平均每個樣品可獲得1 140個OTU。MQ2樣品的Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均具有最大值，分別為5 100、4.19和0.733。由此可見，MQ2麥曲樣品中真菌微生物的豐富度和多樣性均高于其它麥曲樣品。

2.2 基于不同分類地位麥曲中核心真菌菌群分析

納入本試驗的4個黃酒麥曲樣品產(chǎn)生的高質(zhì)量18S rRNA序列中，僅有1.23%和10.72%的序列不能鑒定到門和屬水平。分析發(fā)現(xiàn)，麥曲樣品中的主要真菌門為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycotina）和擔子菌亞門（Basidiomycota），其相對平均含量分別為90.21%、8.18%和0.38%。其中優(yōu)勢真菌門（平均相對含量大于1%）為子囊菌門（Ascomycota），但其在每個樣品中的相對含量存在明顯的差異，其在MQ2樣品中的相對含量最高，在MQ4樣品中的相對含量最低，分別為97.97%和77.76%。進一步對麥曲樣本中優(yōu)勢真菌屬（平均相對含量大于1%）的相對含量進行了分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 優(yōu)勢真菌屬相對含量的比較分析Fig.1 Comparative analysis of average relative abundance of dominant fungal genera

由圖1可知，麥曲樣本中的優(yōu)勢真菌屬有6個，分別為曲霉屬（Aspergillus）、酵母屬（Saccharomyces）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、根霉屬（Rhizopus）、犁頭霉屬（Absidia）和脈孢菌屬（Neurospora），其相對平均含量分別為68.21%、5.06%、4.35%、3.94%、2.29%和2.08%。酵母屬和根霉屬在MQ2樣品中相對含量最高，分別為19.89%和5.56%，曲霉屬和脈孢菌屬在MQ3樣品中的相對含量最高，分別為70.92%和6.48%，橫梗霉屬和犁頭霉屬在MQ1樣品中的相對含量最高，分別為14.67%和8.24%。

于麗娟等[18]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法對南通白蒲黃酒麥曲中真菌群落結(jié)構(gòu)進行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要真菌為隸屬于曲霉屬的白曲霉（Aspergillus candidus）和米曲霉（Aspergillus oryzae），隸屬于枝孢屬（Cladosporium）的芽枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），隸屬于青霉屬（Penicillium）的粒狀青霉（Penicillium granulatum）和產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum），但該報道與本研究的結(jié)論存在明顯差異。譚婷婷等[19]發(fā)現(xiàn)在北方黃酒麥曲中存在大量的霉菌和酵母菌，其分別為隸屬于曲霉屬的米曲霉和雜色曲霉（Aspergillus versicolor），隸屬于橫梗霉屬的多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa），以及隸屬于酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。任清等[20]利用梯度稀釋法和劃線純化法對北宗黃酒麥曲中的微生物進行了分離純化，共得到了5株真菌，其分別為隸屬于根菌屬的Talaromyces radicus，隸屬于曲霉屬的米曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger），隸屬于脈孢菌屬的粗糙脈孢菌（Neurospora crassa），以及隸屬于犁頭霉屬的傘狀犁頭霉（Absidia corymbifera）。上述結(jié)論與本試驗結(jié)論基本一致，由此可見，盡管麥曲的制作工藝和制作環(huán)境會對麥曲中優(yōu)勢微生物的種類和相對含量造成影響，但麥曲中依舊存在大量相同的微生物群落。

2.3 基于OTU水平麥曲中核心真菌菌群分析

本研究進一步在OTU水平上對麥曲中真菌微生物類群進行了揭示，若某個OTU僅在一個樣品中出現(xiàn)，則將其定義為該樣本中的特有OTU，若在全部麥曲樣品中出現(xiàn)則將其定義為核心OTU。對每個樣品中的OTU數(shù)量進行分析的結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于OTU水平的Venn圖Fig.2 Venn diagram based on OTU level

由圖2可知，本研究共劃分了4 558個OTU，其中僅出現(xiàn)1次的OTU個數(shù)為3 477個，占OTU總數(shù)的76.28%，但其包含的序列僅占總序列數(shù)的3.21%；在2個或3個樣本中出現(xiàn)的OTU個數(shù)分別為403個或303個，分別占OTU總數(shù)的8.84%和6.65%，其包含的序列分別占總序列的1.96%和5.14%。雖然麥曲中含有種類繁多的特有微生物類群，但其含量較低，麥曲樣品中存在大量的核心真菌類群。

本研究選取包含序列數(shù)平均相對含量大于0.5%的OTU繪制熱圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3 平均相對含量大于0.5%核心OTU比較分析Fig.3 Comparative analysis of core OTUs with average relative abundance greater than 0.5%

由圖3可知，本研究甄別到的375個核心OTU中，有12個OTU的平均相對含量大于0.5%，分別為 OTU3213、OTU2068、OTU486、OTU2466、OTU3987、OTU3344、OTU4507、OTU1429、OTU623、OTU3245、OTU3417和OTU474，其平均相對含量分別為64.14%、0.78% 、0.84% 、0.53% 、0.73% 、3.12% 、1.37% 、0.94% 、1.21%、0.50%、1.10%和 0.79%。由圖4亦可知，OTU3417和OTU474被鑒定為脈孢霉屬，OTU623和OTU3245被鑒定為根霉屬，OTU4507和OTU1429被鑒定為犁頭霉屬，OTU3987和OTU3344被鑒定為酵母屬，以及 OTU3213、OTU2068、OTU486和 OTU2466 被鑒定為曲霉屬。上述結(jié)果進一步證實了4個麥曲樣本中共有大量的核心真菌類群，12個核心OTU的累計平均相對含量即高達76.05%，且曲霉屬為麥曲中的優(yōu)勢真菌。值得注意的是，核心OTU在不同麥曲中的相對含量亦存在一定的差異，這可能與麥曲樣品的制作環(huán)境和工藝密切相關(guān)。

圖4 核心OTU相關(guān)性分析Fig.4 The correlation analysis of core OTUs

本研究對上述核心OTU之間的相關(guān)性關(guān)系進行了探究，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，OTU3213 與 OTU2068、OTU486、OTU3987和OTU3344均呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。OTU2068與OTU486、OTU3987和OTU3344均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.001），而與OTU2466呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)（P＜0.05）。OTU486與OTU3987和OTU3344均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.001），而與OTU2466呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)（P＜0.05）。OTU2466（隸屬于曲霉屬）與OTU3987和OTU3344呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)（P＜0.05），OTU3987與 OTU3344呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（P＜0.001）。OTU4507與OTU1429呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（P＜0.001），而與OTU3245呈現(xiàn)出非常顯著正相關(guān)（P＜0.01）。OTU1429與OTU3245呈現(xiàn)出非常顯著正相關(guān)（P＜0.001），OTU3417和OTU474呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（P＜0.001）。由此可見，麥曲中的核心菌群之間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系，這可能對維持麥曲中真菌菌群的穩(wěn)定性具有重要的作用。

3 結(jié)論

本研究采用Illumina Miseq測序技術(shù)對黃酒麥曲樣品中的真菌微生物多樣性進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycotina）和擔子菌亞門（Basidiomycota），優(yōu)勢真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）、酵母屬（Saccharomyces）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、根霉屬（Rhizopus）、犁頭霉屬（Absidia）和脈孢菌屬（Neurospora）。雖然黃酒麥曲樣品中含有少量的特有微生物類群，但樣品中依舊存在大量的核心真菌類群。