熒光示蹤及斜向組織切片展示小鼠內(nèi)側(cè)韁核-腳間核神經(jīng)環(huán)路投射

馬夢(mèng)欣 常 欣 李 燊 吳 燕 吳海濤 劉 磊

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京100069；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所 軍事認(rèn)知與應(yīng)激醫(yī)學(xué)研究室，北京 100850)

內(nèi)側(cè)韁核(medial habenular nucleus，MHb)至腳間核(interpeduncular nucleus，IPN)神經(jīng)環(huán)路與腦內(nèi)眾多神經(jīng)環(huán)路一樣，在調(diào)控大腦生理功能方面發(fā)揮重要作用。以往研究[1]顯示，韁核損傷的大鼠在莫里斯水迷宮(空間學(xué)習(xí)和記憶的一項(xiàng)測(cè)試)中比對(duì)照組大鼠游得更快，韁核損傷的大鼠可能對(duì)壓力反應(yīng)較為敏感，并且被損傷的大鼠只有在足部電擊的強(qiáng)度較高(高應(yīng)激)狀態(tài)下，才表現(xiàn)出主動(dòng)回避學(xué)習(xí)受損，而此大鼠在低壓力條件下，回避學(xué)習(xí)行為卻不受影響，這表明韁核損傷的大鼠對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)障礙更敏感。同樣，對(duì)后屈束(fasciculus retroflexus，F(xiàn)r)連接組織造成損傷，則會(huì)導(dǎo)致大鼠血漿皮質(zhì)酮濃度的慢性升高[2]。綜上所述，MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路的主要功能是調(diào)節(jié)動(dòng)物在應(yīng)激狀態(tài)下的學(xué)習(xí)和決策能力。另外，一些使用大鼠、小鼠和斑馬魚(yú)進(jìn)行MHb損傷相關(guān)的研究[3]結(jié)果顯示，MHb-IPN通路在調(diào)節(jié)空間學(xué)習(xí)和記憶、恐懼獲得、被動(dòng)和主動(dòng)回避學(xué)習(xí)以及焦慮方面具有重要作用。

韁核(habenula nucleus，Hb)被第三腦室[4]前后、背側(cè)和后方包圍。Hb有兩個(gè)明顯的成對(duì)分裂，即內(nèi)側(cè)和外側(cè)兩部分。每個(gè)部分都有不同的神經(jīng)纖維的傳入和傳出連接，包括彼此之間的相互連接[5]。兩側(cè)韁核對(duì)應(yīng)亞區(qū)之間存在大量的纖維聯(lián)系，形成韁連合。韁核是前腦與中腦及腦干信息傳遞的中繼站，前腦的傳入纖維主要經(jīng)髓紋到達(dá)韁核，而韁核的傳出纖維則主要經(jīng)Fr投射至中腦和腦干，這為其參與不同的功能提供了環(huán)路基礎(chǔ)[6]。MHb腹側(cè)的投射性神經(jīng)元主要為谷氨酸與乙酰膽堿共釋放的神經(jīng)元IPN的中間區(qū)域，背側(cè)則主要為谷氨酸與 P 物質(zhì)(substance P，SP)共釋放的神經(jīng)元，主要投射到腳間核周邊區(qū)[7]。盡管許多研究使用了腺相關(guān)病毒的順行和逆行追蹤方法，但還未精準(zhǔn)地確定以上兩個(gè)腦區(qū)以及連接組織出現(xiàn)在同一水平面下所能呈現(xiàn)完整的環(huán)路投射的腦組織切割角度，本文通過(guò)對(duì)腦組織進(jìn)行角度切割處理，利用小鼠腦組織切片，熒光成像方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法介紹，為MHb-IPN投射環(huán)路的結(jié)構(gòu)分析和功能研究提供有力技術(shù)手段，具有一定的實(shí)用借鑒價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡野生型(wild type, WT)成年雄性C57BL/6小鼠以及8周齡ChAT-Cre;Ai9紅色熒光報(bào)告小鼠均采購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，獲得審批的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。均飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(軍)2017-0023]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及相關(guān)操作獲軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-DWZX-2020-668)，符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

PCR 儀(德國(guó)Eppendorf公司)，冰凍切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，常溫臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，凝膠成像儀(美國(guó)Alphared公司)，微量注射(中國(guó)瑞沃德公司)，玻璃電極(美國(guó)Sutter公司)，立體定位儀(中國(guó)瑞沃德公司)等。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(中國(guó)索萊寶公司)，75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇(中國(guó)利爾康醫(yī)療公司)，MgCl2、NaCl(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)公司)，冰凍切片包埋劑(日本櫻花公司)，蓋玻片(中國(guó)中衫金橋公司)，含DAPI 封片劑(中國(guó)中衫金橋公司)，戊巴比妥鈉(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)公司)，載玻片(中國(guó)中衫金橋公司)，蔗糖(美國(guó)Thermo公司)等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)工具病毒信息表

所用腺病毒順行示蹤的含人突觸蛋白元件的綠色增強(qiáng)熒光腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus human synapsin enhanced green fluorescent protein，AAV-hSyn-EGFP)，逆向示蹤的綠色增強(qiáng)熒光重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus2-retro-enhanced green fluorescent protein，rAAV2-retro-EGFP)，詳見(jiàn)表1。

表1 腺病毒列表Tab.1 Adenovirus list

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定

1)基因組制備：①基因提取: 消毒眼科剪刀快速剪下約0.5 mm 的鼠尾和腳趾，取下的組織樣品放在 1.5 mL EP 管中，注意標(biāo)記 EP 管上小鼠標(biāo)號(hào)。②配制裂解液：蛋白酶 K(2 μL)+Mg2+緩沖液(10 μL)+H2O(88 μL)，每個(gè)EP管內(nèi)總體為 100 μL 體系，向放入組織并編好號(hào)的EP管中加入裂解液，離心機(jī)瞬時(shí)離心(確保樣品置于裂解液中)。③ 56 ℃水浴鍋裂解 5～6 h 或過(guò)夜。④取出后放入電磁爐 100 ℃煮沸樣品 10 min。⑤放入離心機(jī)12 000 r/min，5 min后置于 4 ℃保存。⑥制備反應(yīng)體系并放入PCR 儀中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為Ai9基因：94 ℃熱變性2 min，然后94 ℃變性20 s，65 ℃復(fù)性15 s，68 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min，8 ℃保溫。ChAT基因：94 ℃熱變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min，8 ℃保溫。

2)基因型鑒定：①制備瓊脂糖凝膠：稱質(zhì)量2 g的 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠溶于 100 mL 1×TAE 后，置于錐形瓶中微波爐加熱溶解后，稍作冷卻加入10 μL Gel Red 核酸染料后混勻，進(jìn)行插排梳、倒板，直至完全冷卻，液體轉(zhuǎn)為固體后拔梳。②上樣：每排第一個(gè)孔上加入標(biāo)記條帶Marker 10 μL，后面依次加入擴(kuò)增后的樣本體系液。③電泳程序: 電壓140 V，時(shí)間30 min。④紫外線下照膠，記錄結(jié)果，并核對(duì)小鼠編號(hào)，選取符合條件的基因型小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)隨機(jī)分組方法

使用SPSS 13.0軟件對(duì)入組對(duì)象進(jìn)行編號(hào)，為了使上述分組結(jié)果具有重現(xiàn)性，在分組之前設(shè)定隨機(jī)種子，然后通過(guò)生成一列隨機(jī)數(shù)字并將其命為Random，利用Rv-Uniform函數(shù)在設(shè)定范圍內(nèi)生成一系列隨機(jī)數(shù)字，最后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字大小進(jìn)行排序分組，使用Visual Binning功能快速分組，命名為新劃分的組別名稱，即可得到隨機(jī)分組結(jié)果。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠分組

ChAT-Cre;Ai9熒光報(bào)告小鼠則根據(jù)基因鑒定結(jié)果依次選出5只，設(shè)為熒光報(bào)告小鼠組(A組)；將10只WT小鼠采用1.2.2中的分組方法隨機(jī)分配到B、C兩組，給予不同的病毒注射，其中B為順行病毒示蹤組，C為逆行病毒示蹤組，每組各5只。

1.2.4 重組腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated virus，AAV)病毒注射前手術(shù)準(zhǔn)備過(guò)程

1)動(dòng)物手術(shù)前麻醉、備皮：①小鼠腹腔注射濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉進(jìn)行小鼠麻醉。②用單層剃須刀片刮掉小鼠頭頂上的毛發(fā)。③將小鼠放在加熱墊上，以保持穩(wěn)定的體溫(注：小鼠麻醉后不能調(diào)節(jié)體溫，將其放在加熱墊上可以避免手術(shù)過(guò)程中體溫明顯下降)。④在小鼠的眼睛上涂上紅霉素軟膏，以防止手術(shù)中眼部的干澀以及強(qiáng)光照射導(dǎo)致的不適。⑤使用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對(duì)頭部皮膚進(jìn)行消毒。

2)動(dòng)物固定以及病毒注射準(zhǔn)備：①將小鼠的門牙固定在立體定向儀上適配器的前夾上，調(diào)整適配器的位置，使耳桿可以很容易地插入耳道，使頭部較平穩(wěn)地固定住(注：確保小鼠頭部牢固地固定在適配器的前夾上)。②用手術(shù)刀做一個(gè)1.5 cm的前后切口。③用含0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)的無(wú)菌棉簽輕輕擦拭以清潔頭骨表面，確保前后囟點(diǎn)以及顱骨縫清晰可見(jiàn)。④將玻璃電極中注滿礦物油，用熱熔膠固定于10 μL的微量注射器上，并排出管內(nèi)以及玻璃電極內(nèi)所有氣泡。將制好的微量注射器固定于微量注射泵上吸取適量病毒準(zhǔn)備注射。

1.2.5 腦立體定位及病毒微量注射

1)腦立體定位與注射坐標(biāo)：腦立體定位與注射坐標(biāo)示意圖詳見(jiàn)圖1A、B、C。

2)顱鉆開(kāi)顱：①將針尖移動(dòng)到前囟點(diǎn)調(diào)平零點(diǎn)，作為三個(gè)軸的參照點(diǎn)，從這一點(diǎn)確定其他坐標(biāo)。②通過(guò)前后囟點(diǎn)顯示的高度，調(diào)整頭部至水平。③根據(jù)小鼠腦圖譜冊(cè)定位至MHb坐標(biāo)位點(diǎn)后利用顱骨鉆進(jìn)行直徑0.5 mm的淺小孔(切勿鉆入大腦，防止皮質(zhì)損傷)(圖1 D)，同上操作，在IPN位點(diǎn)也進(jìn)行鉆孔(圖1 E)。

3)AAV病毒微量注射方法：①隨后將注射器插入到已鉆好孔處MHb目標(biāo)腦區(qū)(圖1 F)、IPN目標(biāo)腦區(qū)(圖1G)進(jìn)行病毒注射。②MHb病毒注射具體坐標(biāo)為：小鼠腦背側(cè)到腹側(cè)(dorsal-ventral，DV)：-2.50 mm、前端到后端(anterior-posterior，AP)：-1.06-2.06 mm、內(nèi)側(cè)到外側(cè)(medial-lateral，ML)：0.25 mm(圖1B)；IPN具體坐標(biāo)為：DV：-4.65 mm、AP：-3.45～-3.52 mm、ML：0.00 mm(圖1C)。③順行示蹤病毒：AAV-hSyn-EGFP注射速度為8 nL/min，注射量為80 nL，逆行示蹤病毒：rAAV-retro-EGFP注射速度為30 nL/min，注射量為300 nL。等待病毒注射完成后至少停針10 min后緩慢移出。④手術(shù)完成后縫合切口，等待小鼠蘇醒，病毒注射完成后飼養(yǎng)3周后心臟灌流后取腦。

圖1 立體定位注射腺病毒到成年小鼠內(nèi)側(cè)韁核和腳間核區(qū)域Fig.1 The virus was injected stereoscopically into the medial habenular nucleus and interpeduncular nucleus regions of adult mice

1.2.6 小鼠腦組織切片樣本制備

1)小鼠腦組織灌流固定：①首先稱小鼠體質(zhì)量，按照體質(zhì)量腹腔適量注射1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉，等待小鼠深度麻醉后，小心剪開(kāi)小鼠胸腔，充分暴露心臟。②分別用生理鹽水和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛從左心室緩慢灌流(在通風(fēng)櫥進(jìn)行)，出現(xiàn)肝臟完全變白，右心耳處無(wú)血液流出以及推入 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液致小鼠尾巴輕輕顫動(dòng)，小鼠四肢僵硬狀態(tài)后，即完成灌流過(guò)程。③隨后將腦組織完整取出，放入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液中，于4 ℃冰箱中后固定24 h。

2)腦片制備步驟：①固定完成后，依次用15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))濃度的蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水，直至腦組織樣品沉入蔗糖溶液底部，約48 h。②取出腦組織后用濾紙仔細(xì)吸干表面的蔗糖溶液.首先將腦組織兩側(cè)部分組織平行切割，兩側(cè)厚度約0.1 mm，保證整體組織的矢狀面放置在平面時(shí)較為穩(wěn)定，方便切割操作(圖2A，B)。③將其以矢狀呈現(xiàn)面放置在已制作好的34°平行切割角度的具有防水層的底板上(圖2C)，矢狀腦組織切割完成后(圖2D～F)，隨后以冠狀切片方向?qū)⒛X組織放入腦組織凍存模具中(圖2 G)，使用聚乙二醇和聚乙烯醇(optimal cutting temperature compound,OCT)在冰凍切片機(jī)中進(jìn)行包埋固定(圖2 H)。④等待30 min后，樣品徹底固定后，使用冰凍切片機(jī)切成厚度一般為40 μm的冠狀腦片，貼在載玻片上晾干防止掉片。⑤最后使用PBS清洗3次，每次5 min，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。將含有DAPI的封片劑滴在玻片上進(jìn)行封片，盡量避免氣泡，然后用指甲油密封。

圖2 小鼠斜向切片腦組織樣本修整以及制備Fig.2 Trimming and preparation of brain tissue samples from oblique sections of mice

1.2.7 熒光成像及數(shù)據(jù)分析

將封片后并晾干的小鼠腦組織切片用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集。首先對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片圖像，選用10×光學(xué)鏡頭，在軟件中選中Z-stack，顯示Multidimensional acquisition菜單，在此菜單分別設(shè)置起止點(diǎn)，常用start/end設(shè)置起止點(diǎn)模式，在圖像預(yù)覽時(shí)設(shè)置成像范圍的起點(diǎn)和終點(diǎn)，同時(shí)設(shè)置光學(xué)掃描切片之間的間隔層數(shù)，若無(wú)確定把握可參考Optimal功能設(shè)置間隔層數(shù)和數(shù)量，采用系統(tǒng)推薦數(shù)值。下一步進(jìn)行目標(biāo)視野范圍下大視野拼圖過(guò)程，對(duì)目標(biāo)區(qū)域按照設(shè)置進(jìn)行每個(gè)局部組織的層掃，結(jié)束后拼接成完整成像，如圖3整體圖像拼接大小為9(長(zhǎng))×6(寬)左右。最后得到完整拼接圖后，導(dǎo)出圖像并利用Adobe Illustrator軟件下的文字和套索工具結(jié)合艾倫(Allen brain)小鼠腦圖譜冊(cè)對(duì)比分析，確定圖像中的解剖結(jié)構(gòu)，對(duì)目標(biāo)腦區(qū)區(qū)域較為準(zhǔn)確地做出標(biāo)記。

圖3 ChAT-Cre;Ai9紅色熒光報(bào)告小鼠MHb-IPN環(huán)路投射Fig.3 ChAT-Cre;Ai9 red fluorescence report mouse MHb-IPN projection display

2 結(jié)果

AAV是一種強(qiáng)大的工具，該技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價(jià)值，腺病毒可用于特定腦區(qū)靶向注射從而發(fā)現(xiàn)上下游所關(guān)聯(lián)的腦區(qū)，在MHb區(qū)域注射順行示蹤病毒(AAV2/9-hSyn-EGFP)用以示蹤其下游IPN腦區(qū)(圖4)，在IPN注射逆行示蹤病毒(rAAV2-retro-EGFP)用以追蹤其上游MHb腦區(qū)(圖5)。分別注射綠色熒光病毒至小鼠大腦兩個(gè)腦區(qū)，最后根據(jù)斜切的矢狀熒光圖均顯示MHb-IPN有穩(wěn)定的投射關(guān)系，是以兩條后屈束(Fr)從MHb區(qū)投射到下游IPN區(qū)。

圖4 MHb(雙側(cè))注射順行示蹤病毒AAV2/9-hSyn-EGFP投射結(jié)果Fig.4 AAV2/9-hSyn-EGFP injected into bilateral MHb region was traced to IPN display

圖5 IPN注射逆行示蹤病毒rAAV2-retro-EGFP投射結(jié)果Fig.5 Retrograde tracing of IPN injected virus rAAV2-retro-EGFP

3 討論

在內(nèi)側(cè)韁核-角間核通路存在大量乙酰膽堿能的神經(jīng)投射，本研究通過(guò)利用腺病毒工具以及ChAT-Cre;Ai9報(bào)告小鼠來(lái)展示在特定的角度34°斜向切片的技術(shù)下MHb-IPN兩腦區(qū)之間通過(guò)后屈束(Fr)連接結(jié)構(gòu)形成的完整的上下游投射關(guān)系。

首先，MHb-IPN環(huán)路上存在非常多且重要的功能聯(lián)系，Hb是前腦和中腦及腦干之間信息傳遞的中繼站，與前額葉、隔核、被蓋和腦干的單胺類核團(tuán)有廣泛的纖維聯(lián)系[8]。因?yàn)檫@些腦區(qū)與精神障礙、情緒和認(rèn)知功能密切相關(guān)，所以韁核在神經(jīng)和精神疾病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。現(xiàn)有研究[9]顯示，韁核在神經(jīng)病理性疼痛、抑郁癥、藥物成癮和精神分裂癥等多種神經(jīng)、精神疾病中發(fā)揮作用。

IPN比大腦的其他任何部分都表現(xiàn)出更依賴膽堿能神經(jīng)傳遞的過(guò)程[10-11]，但I(xiàn)PN對(duì)乙酰膽堿的利用途徑還未清晰確定，但可能主要來(lái)自MHb的投射[12]。MHb區(qū)神經(jīng)元和投射到IPN中央和中間亞核的末端區(qū)中都存在大量的ChAT[13-15]。然而，MHb也釋放其他神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，包括SP物質(zhì)，也稱速激肽 1[16-17]，廣泛分布于扣帶回皮質(zhì)、海馬、杏仁核和下丘腦的各個(gè)區(qū)域，這可能與應(yīng)激和情感反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[18]，研究者們將逐漸揭示韁核參與精神障礙相關(guān)疾病的分子及環(huán)路機(jī)制，并不斷開(kāi)發(fā)以韁核為靶點(diǎn)的治療措施。

腦內(nèi)神經(jīng)環(huán)路是實(shí)現(xiàn)情感與記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)，大腦高級(jí)功能的實(shí)現(xiàn)依賴于多種神經(jīng)元之間的相互投射，而這些投射所構(gòu)成的神經(jīng)環(huán)路會(huì)對(duì)接收到的復(fù)雜信息進(jìn)一步傳遞與處理。想要揭示情感包括記憶在內(nèi)的腦功能原理以及腦疾病發(fā)病機(jī)制，首先需要掌握相應(yīng)神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)與功能信息[19]。能夠深入了解特定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與發(fā)展、行為和學(xué)習(xí)的關(guān)系一直是神經(jīng)科學(xué)的一個(gè)重要目標(biāo)，隨著影像學(xué)、分子生物學(xué)和光遺傳學(xué)等技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用新型技術(shù)去了解大腦中MHb-IPN特定環(huán)路投射發(fā)揮的功能和機(jī)制作用，以及單個(gè)分子在這個(gè)環(huán)路中的影響，逐漸成為了熱門的研究領(lǐng)域，但是這些問(wèn)題在一定程度上的解決也依賴于神經(jīng)環(huán)路水平上的示蹤和功能研究，同時(shí)以上的神經(jīng)生物學(xué)研究的成功實(shí)施需要具有高度針對(duì)性、高效和精確的方法。

在具體實(shí)驗(yàn)操作中需要注意以下技術(shù)細(xì)節(jié)，例如①在對(duì)腦組織進(jìn)行修正和切割時(shí)，使用吸水濾紙能夠吸附組織表面的液體，一方面在多維度進(jìn)行切割操作時(shí)不易造成切割失誤，同時(shí)能提高切割角度的準(zhǔn)確性；②小鼠腦組織在脫水過(guò)程時(shí)，要盡量保證脫水完全，以減少后期在冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶，一方面加快了冷凍速度，另一方面組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)就保存的越好，貼在載玻片上的腦組織切片的表面氣泡數(shù)量少并且質(zhì)量高，同時(shí)在鏡下所呈現(xiàn)出的圖像質(zhì)量也越高；③首次調(diào)整刀片與包埋組織夾角角度后，后續(xù)不可再次調(diào)整角度，以保證整個(gè)組織平面盡量以相同的角度與刀片接觸，避免偏差；④冰凍溫度和時(shí)間是切片的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，溫度不宜過(guò)冷或過(guò)高，小鼠腦組織質(zhì)地比較嫩，溫度不宜過(guò)低，-7 ℃～-10 ℃即可，冰凍時(shí)間取決于OCT包埋劑變?yōu)椴煌该鳡畹臅r(shí)間，不宜預(yù)先冷凍或過(guò)久冷凍，防止發(fā)生洗片過(guò)程出現(xiàn)脫片現(xiàn)象；⑤在保證MHb兩側(cè)病毒注射劑量一致的情況下，兩側(cè)熒光強(qiáng)度不同，可能是由于病毒注射后，玻璃電極需要在腦內(nèi)停留10 min，在留針時(shí)間內(nèi)和抽針過(guò)程中，病毒液體可能有部分滲漏導(dǎo)致，但實(shí)際注射深度確在MHb區(qū)范圍以內(nèi)，理論上不影響目標(biāo)區(qū)域的示蹤及觀察。

大腦神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析是研究大腦功能的基礎(chǔ)，而傳統(tǒng)解析MHb-IPN投射的神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的方法，是將冷凍后的腦組織按照常規(guī)冠狀或矢狀切法，將組織切成20～30 μm厚度的腦組織薄片，附著在載玻片上，隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察和多層拍照，但是這種傳統(tǒng)方法花費(fèi)人力、物力以及時(shí)間更多，并且會(huì)將神經(jīng)纖維切斷，很難完整地展示每一張切片上連續(xù)的纖維，從而導(dǎo)致部分有效信息丟失，觀察到的結(jié)果與真實(shí)結(jié)果之間，往往存在部分偏差，不利于精準(zhǔn)解析全腦的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。

綜上，本文驗(yàn)證了MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路投射關(guān)系并介紹了一種能夠精準(zhǔn)把握腦組織切片角度并完整展示MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路投射的組織切片技術(shù)方法。通過(guò)對(duì)小鼠整體腦組織三個(gè)面不同角度和厚度的切割，可以實(shí)現(xiàn)將MHb、IPN和Fr三部分完整地呈現(xiàn)并且展示出整體的連接結(jié)構(gòu)，能夠在同一水平面下較為清晰地觀察到以上兩個(gè)腦內(nèi)深部核團(tuán)中的神經(jīng)元活性以及細(xì)胞分泌水平的變化，并且可進(jìn)行直觀地分析和差異比較，在全腦尺度上獲得精確的MHb-IPN神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)信息，為研究?jī)蓚€(gè)重要核團(tuán)連接之間發(fā)揮的功能和探索兩者存在的神經(jīng)環(huán)路調(diào)控機(jī)制提供了直觀、精準(zhǔn)的觀察和分析手段。本技術(shù)將為內(nèi)側(cè)韁核區(qū)域相關(guān)投射的神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)與功能研究提供有效環(huán)路投射成像技術(shù)支撐。