新型冠狀病毒核酸PCR檢測(cè)假陽(yáng)性核酸污染類型的鑒別方法

王 爽 潘 陽(yáng) 徐新民 栗雅杰 周 淳 張 悅 王雅杰*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100015； 2. 北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病地方病控制所，北京 100013)

隨著新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情的爆發(fā)和流行，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)核酸檢測(cè)已經(jīng)成為各臨床實(shí)驗(yàn)室不可缺少的檢測(cè)項(xiàng)目。大規(guī)模爆發(fā)和聚集性疫情的產(chǎn)生使得實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)壓力出現(xiàn)前所未有的增加[1-2]。面對(duì)檢測(cè)任務(wù)的增加，實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)行是最重要的保障，其中避免實(shí)驗(yàn)室污染以及實(shí)驗(yàn)室一旦發(fā)生核酸污染后的消除也是實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人必須重視的一項(xiàng)內(nèi)容。

假陽(yáng)性主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染、標(biāo)本污染、非特異性擴(kuò)增等[2-3]。個(gè)別假陽(yáng)性情況能通過復(fù)查核酸或重新提取后糾正過來(lái)。如出現(xiàn)一些特殊情況，如一個(gè)96孔板中有很多陽(yáng)性，或重復(fù)測(cè)試仍為陽(yáng)性，但這種檢測(cè)結(jié)果和流行病學(xué)或臨床不符，就必須考慮是實(shí)驗(yàn)室本身的問題。篩查為主的核酸檢測(cè)機(jī)構(gòu)出現(xiàn)檢測(cè)假陽(yáng)性主要是陽(yáng)性質(zhì)控品造成的，包括含待測(cè)基因的質(zhì)?；蚣俨《?。對(duì)于收治確診患者的定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)或接觸入境陽(yáng)性人員的實(shí)驗(yàn)室，如實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)?shù)仍颍?yáng)性樣本發(fā)生溢撒或產(chǎn)生大量氣溶膠，可使周圍環(huán)境被病毒污染[4-6]。實(shí)驗(yàn)室一旦發(fā)生核酸污染，檢測(cè)工作必須緊急停止，直到確定消除污染后才能重新開始檢測(cè)。發(fā)生核酸污染后需要第一時(shí)間查找污染源和污染原因，明確原因后才能采取有效的去污染措施。本文的目的是建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的污染鑒別方法，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)污染后，能及時(shí)鑒定出污染類型，從而縮小并明確造成污染的原因，使得檢測(cè)工作盡快恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

A組DNA質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品：含N基因、ORF1ab基因片段；B組RNA假病毒陽(yáng)性質(zhì)控品：含N基因、ORF1ab基因片段的假病毒和RNP基因的假病毒混合物；實(shí)驗(yàn)當(dāng)日5例確診患者弱陽(yáng)性核酸樣本，編號(hào)為S101、S102、S103、S104和S110。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：2020-060)。所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑

天隆Gentier 96E型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司；核酸提取試劑(QIAamp Viral RNA Mini Kit，批號(hào)：166020025)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；達(dá)安新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào):2021056)購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；DNase為TURBO DNA-freeTM試劑盒(Invitrogen，批號(hào)：01049921)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的處理

由污染引起的擴(kuò)增都在較高循環(huán)閾值cycle threshold (Ct)水平，使用無(wú)RNA酶水將A組DNA質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行4個(gè)稀釋度(5、25、125和625倍)的稀釋。B組假病毒已知濃度為1×104拷貝/mL，無(wú)須稀釋。選取的5例確診患者核酸樣本ORF1ab基因和N基因PCR檢測(cè)的原始Ct值在33～40之間，無(wú)須稀釋。

1.3.2 DNase的使用

吸取15 μL樣本到0.5 mL EP管中，加入2 μL 10×TURBO DNase 緩沖液和1 μL TURBO DNase。對(duì)照組為15 μL樣本加入2 μL 10×TURBO DNase 緩沖液和1 μL H2O，金屬浴37 ℃反應(yīng)30 min。在反應(yīng)后的各管中加入2 μL DNase 滅活劑，室溫放置5 min，離心2 min，吸取上清作為下一步模板。

1.3.3 PCR反應(yīng)程序

根據(jù)達(dá)安新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒說明書中的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序詳見表1，在進(jìn)行RNA組分鑒別時(shí)，去掉步驟1的反轉(zhuǎn)錄過程，只保留步驟2和步驟3進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)通道為：VIC通道(ORF1ab基因)、FAM通道(N基因)和CY5通道(內(nèi)標(biāo)RNP基因)。由于不同廠家的檢測(cè)試劑差異，對(duì)于A組和B組陽(yáng)性質(zhì)控品，達(dá)安新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒只能擴(kuò)增出N基因，不能擴(kuò)增出ORF1ab基因。

表1 PCR反應(yīng)程序Tab.1 PCR setup

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DNase對(duì)不同模板濃度(稀釋度)的抑制情況比較

使用DNase進(jìn)行DNA類型污染的鑒別，由于實(shí)際工作中DNase的使用是按照說明書進(jìn)行的，對(duì)于模板的濃度含量是否產(chǎn)生不同的結(jié)果需要實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。將A組DNA質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品的4種稀釋水平使用DNase處理前后的N基因擴(kuò)增檢測(cè)情況，結(jié)果如圖1所示，A圖顯示對(duì)照組在4種稀釋水平均可以正常擴(kuò)增出N基因的擴(kuò)增曲線，B圖顯示的DNA型陽(yáng)性質(zhì)控品在經(jīng)DNase處理后均無(wú)法擴(kuò)增出目標(biāo)片段，表明DNase對(duì)各稀釋度的DNA模板都可以清除降解。

圖1 比較DNase處理與否對(duì)DNA質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增情況影響Fig.1 Comparison of the amplification of DNA plasmid positive quality control samples with or without DNase treatment

A：theNgene amplification curves of four positive quality control samples with different dilutions;B：no amplification curve in four DNase treatment groups;RFU: relative fluorescence units.

2.2 DNase不同處理時(shí)間的擴(kuò)增結(jié)果比較

為探討DNase處理時(shí)間對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，使用DNase處理2.1中4種稀釋度的DNA質(zhì)粒質(zhì)控品，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為15、30和60 min。將酶消化后的DNA質(zhì)控品作為擴(kuò)增模板進(jìn)行靶基因(N基因)的擴(kuò)增，Ct值結(jié)果如表2所示，將4個(gè)稀釋度下對(duì)照組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的N基因Ct值進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)顯示3組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4個(gè)稀釋度下DNase處理15、30和60 min后檢測(cè)N基因均無(wú)曲線擴(kuò)增，說明DNase處理時(shí)間在15 min以上均可起到清除DNA模板的作用。

表2 A組DNA質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品在對(duì)照和DNase不同作用時(shí)間下N基因檢測(cè)Ct值比較Tab.2 Comparison of Ct value of N gene of DNA plasmid positive quality control samples at 3 different DNase treatment time

2.3 DNase對(duì)RNA成分?jǐn)U增的影響

為探索DNase對(duì)RNA擴(kuò)增的影響，使用DNase處理RNA型假病毒的陽(yáng)性質(zhì)控品。從圖2中可以看出，RNA型假病毒的陽(yáng)性質(zhì)控品經(jīng)DNase處理前(圖2A)、后(圖2B)，ORF1ab和N基因的擴(kuò)增曲線并沒有發(fā)生變化。而從陽(yáng)性患者標(biāo)本的擴(kuò)增曲線看(圖2C、D)，經(jīng)DNase處理后的曲線會(huì)發(fā)生后移，Ct值相應(yīng)增大(圖3，表3)。值得注意的是，當(dāng)檢測(cè) Ct 值過高的核酸樣本時(shí)，DNase處理后會(huì)使核酸濃度有所降低，可能會(huì)導(dǎo)致高Ct值(灰區(qū)附近)的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性(表3)。

圖2 DNase處理不影響RNA組分的擴(kuò)增。Fig.2 The amplification of RNA components was not affected with DNase treatment

表3 5例患者核酸經(jīng)DNase處理后ORF1ab和N基因的Ct值檢測(cè)結(jié)果變化Tab.3 Comparison of Ct values of ORF1ab and N genes after DNase treatment in 5 confirmed patients

2.4 RNA類污染的鑒別

A組DNA質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品、B組RNA類型假病毒，按試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)條件，將步驟1反轉(zhuǎn)錄(50 ℃,15 min)去除后，開始擴(kuò)增檢測(cè)。從圖3A、B兩圖可以看出，完整反應(yīng)條件下可以擴(kuò)增出RNA類型假病毒的N基因和RNP內(nèi)標(biāo)基因，去除這一步驟則不能擴(kuò)增出目的片段；質(zhì)粒型陽(yáng)性質(zhì)控品為DNA成分，去掉反轉(zhuǎn)錄后(圖3D)仍然能和完整反應(yīng)條件下一樣(圖3C)正常擴(kuò)增，且Ct值接近原始核酸檢測(cè)Ct值，提示DNA成分沒有反轉(zhuǎn)錄過程也可以正常擴(kuò)增。

圖3 去除反轉(zhuǎn)錄步驟的擴(kuò)增可以對(duì)比驗(yàn)證RNA類型的污染情況Fig.3 The amplification without reverse transcription in RT-PCR could be used to identify and verify the contamination of RNA type

2.5 核酸污染類型鑒別

由于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法通常無(wú)法區(qū)分所檢測(cè)核酸片段的類型，通過結(jié)合去除反轉(zhuǎn)錄步驟以及使用DNase兩種處理方式比較前后結(jié)果的變化來(lái)鑒別核酸污染類型。①去除反轉(zhuǎn)錄步驟結(jié)果無(wú)變化，DNase處理后結(jié)果陰性，可鑒定為DNA類型污染；②去除反轉(zhuǎn)錄步驟結(jié)果陰性，DNase處理后無(wú)變化，可鑒定為RNA類型污染；③去除反轉(zhuǎn)錄步驟結(jié)果陰性，DNase處理后Ct值增高或結(jié)果為陰性，可鑒定為RNA類型污染(模板被DNase稀釋所致)；④單獨(dú)通過去除反轉(zhuǎn)錄步驟、DNase處理步驟后結(jié)果為陽(yáng)性，說明存在DNA和RNA兩種類型共同污染(表4)。

表4 核酸污染類型鑒定策略總結(jié)Tab.4 Summary of identification strategy

3 討論

核酸檢測(cè)具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，但對(duì)于核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要從多方面因素來(lái)保證。由于核酸檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果被視為SARS-CoV-2感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2,7-8]，陽(yáng)性結(jié)果的報(bào)告直接決定相關(guān)疫情的后續(xù)處理，因樣本在實(shí)驗(yàn)室受污染而導(dǎo)致“陽(yáng)性”的情況在很多實(shí)驗(yàn)室都出現(xiàn)過，而假陽(yáng)性情況則會(huì)造成人員恐慌以及流行病學(xué)調(diào)查和防控措施過度等問題[9-10]。除了考慮實(shí)驗(yàn)室生物安全、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等措施[11-12]，根據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的基本原理和條件，從檢測(cè)樣本采集、運(yùn)輸、保存的方式，試劑盒的質(zhì)量，以及臨床實(shí)驗(yàn)室的管理等多方面，鑒定出污染類型的工作也是應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)“假陽(yáng)性”的重要工作之一。

這里筆者分別結(jié)合DNA型陽(yáng)性質(zhì)控品、RNA型陽(yáng)性質(zhì)控品和陽(yáng)性患者核酸標(biāo)本使用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的試劑來(lái)進(jìn)行污染類型的鑒別并總結(jié)。使用商品化DNase處理鑒定DNA類型的污染已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。對(duì)于Ct值高至29(1∶5稀釋)的陽(yáng)性質(zhì)控品，將反應(yīng)時(shí)間減少至15 min都可以通過DNase清除抑制，從而鑒定出DNA污染類型[13-14]。本結(jié)果也顯示，鑒定低載量(較高Ct值)樣本核酸時(shí)，DNA酶處理后可能會(huì)使RNA濃度進(jìn)一步降低，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為陰性。實(shí)際上，很多污染現(xiàn)象都是以小翹尾的形式出現(xiàn)的，應(yīng)使用另外一到兩種擴(kuò)增不同區(qū)域的高靈敏檢測(cè)試劑進(jìn)行驗(yàn)證。RNA類的污染可見于滅活疫苗的污染，含有靶基因的假病毒污染，陽(yáng)性樣本的污染等。一些操作失誤如加樣器深入陽(yáng)性樣本采樣管時(shí)沾染，表面活性劑在管口產(chǎn)生氣泡或液體滴撒操作臺(tái)面等均可能導(dǎo)致核酸污染。同時(shí)，有證據(jù)[6]顯示SARS-CoV-2的氣溶膠傳播，在這些患者產(chǎn)生的氣溶膠濃度達(dá)到105拷貝/mL。對(duì)于RNA類型的鑒別，最直接有效的方法即將完整的實(shí)時(shí)熒光定量PCR步驟去除反轉(zhuǎn)錄過程，使得RNA成分無(wú)法反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而中斷目標(biāo)基因的擴(kuò)增。這一方法的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單快速，不需要額外的試劑，唯一的不足是痕量DNA的污染也會(huì)影響最后的污染類型推斷。

各個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有應(yīng)對(duì)污染的有力措施。首先是實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施保障，比較理想的結(jié)構(gòu)是在獨(dú)立的PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取和加樣，然后將加完樣的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)運(yùn)至擴(kuò)增室進(jìn)行擴(kuò)增。這樣既可以避免擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)樣本制備過程的污染，也可以避免樣本制備區(qū)泄漏的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于常出現(xiàn)的擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物污染，很多好習(xí)慣是簡(jiǎn)單易行的，如對(duì)完成的PCR反應(yīng)管蓋嚴(yán)后迅速放入密閉的醫(yī)療垃圾桶并及時(shí)處理；加強(qiáng)擴(kuò)增區(qū)的消毒(消毒劑擦地、紫外燈照射)和通風(fēng)。無(wú)論是怎樣的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置，盡可能實(shí)施空氣通風(fēng)來(lái)消除SARS-CoV-2氣溶膠是預(yù)防污染的最佳手段[6]。引起實(shí)驗(yàn)室假陽(yáng)性的原因多種多樣，涉及實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的方方面面，尋找準(zhǔn)確原因不是件容易的事。但是，可以通過先鑒別出污染的類型來(lái)縮小懷疑的范圍，以便逐一排查，最后準(zhǔn)確定位。另一方面，準(zhǔn)確地了解污染情況對(duì)開展預(yù)防工作也是十分重要的提示，很有可能鑒定出的污染情況是以前沒有關(guān)注過的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣和手法，對(duì)生物安全意識(shí)和更正操作步驟都很有意義。后期筆者會(huì)將這一方法應(yīng)用到實(shí)際工作中，如出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、確診患者病區(qū)及與流行病學(xué)不符的人員標(biāo)本等檢測(cè)出現(xiàn)結(jié)果陽(yáng)性的情況，通過本方法來(lái)鑒別出所測(cè)標(biāo)本陽(yáng)性的類型，并確定與實(shí)際結(jié)果不符的原因，為方艙實(shí)驗(yàn)室新型冠狀病毒核酸檢測(cè)積累更多經(jīng)驗(yàn)。