大鼠血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平濃度的LC-MS測定方法

蘭 雪,陳曾妮,周旭美,3,4,韓敏珍,唐富山,3,4

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 凱里 556000；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；4.遵義市臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563006)

藥物-藥物、藥物-食物相互作用導(dǎo)致藥物血藥濃度異常波動時，就可能誘發(fā)不良事件的發(fā)生，這不僅與合理用藥的宗旨相違背，甚至可能危及患者的生命安全[1-2]。大部分的藥物相互作用主要發(fā)生在藥物代謝環(huán)節(jié)，而藥物對細(xì)胞色素P450(CYP)酶的影響是藥物相互作用最主要和常見的原因。藥物對CYP酶的影響可通過探針?biāo)幬锓ǖ榷喾N方式進(jìn)行評價，尋求可用于評估藥物相互作用的探針?biāo)幬镅芯糠椒ㄖ陵P(guān)重要[3-4]。在CYP酶系中，50%的藥物經(jīng)CYP3A酶代謝，硝苯地平是CYP3A酶的特異性底物，可在人體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為氧化硝苯地平[5]。以硝苯地平作為探針?biāo)幬?，通過研究硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平的藥動學(xué)可以評估有關(guān)藥物對CYP3A酶活性的影響，從而預(yù)測可能的藥物相互作用[6]。雖然已有文獻(xiàn)報道關(guān)于測定硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平血藥濃度的方法，但在血漿樣品處理、取材的方式方法、色譜條件選擇等方面仍有待優(yōu)化。因此，本實(shí)驗(yàn)建立并優(yōu)化了測定大鼠血漿中硝苯地平及其代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的血藥濃度的LC-MS方法，并進(jìn)行了初步的藥動學(xué)研究驗(yàn)證。

1 材料

1.1 儀器 液相色譜儀購自島津公司(型號：20XR AD)，質(zhì)譜儀購自ABSCIEX公司(型號：API4000 Qtrap)，配置有電噴霧離子源。高速冷凍離心機(jī)Thermo Fisher購自德國(型號：D-3570Osterode),純水儀購自瑞飛樂生物科技有限公司(型號：S5PXC0501)。

1.2 藥品與試劑 硝苯地平原料藥(購自廣州優(yōu)瓦儀器有限公司，批號：100338201404，純度：99.0 %)。硝苯地平對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100338，純度：99.9%)。氧化硝苯地平對照品(購自西格瑪集團(tuán)有限公司，批號：043M3903V，純度：99.5%)。尼群地平對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100585-201104，純度：99.0%)。乙醚、乙酸乙酯、正己烷等試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。流動相甲醇為色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水為純水儀自制去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年SD大鼠6只，雄性，SPF級，體重(220±20)g，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號為SCXK(渝)2017-0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品儲備液 分別精密稱定硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平對照品，用甲醇溶解后定容，分別配制成質(zhì)量濃度為390.00、90.00、10.00 μg/mL的儲備液，密封于棕色容量瓶中，置于-20 ℃冰箱中保存。用于配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的儲備液均由濃度為390.00、90.00、10.00 μg/mL的硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平溶液逐步稀釋，質(zhì)控樣品(溶液)獨(dú)立稱取，配制。

2.1.2 硝苯地平的淀粉漿混懸液的配制 取60 mL蒸餾水水浴加熱至85 ℃，加入檸檬酸0.6 g，攪拌使之溶解，加入可溶性淀粉1.2 g，持續(xù)攪拌，加入硝苯地平原料藥，攪拌均勻，待冷卻，供大鼠灌胃給藥用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線所需樣品溶液的配制 取硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成硝苯地平質(zhì)量濃度分別為5.27、4.40、3.30、1.65、8.25×10-1、8.25×10-2、8.25×10-3μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。另取一份硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋配制成濃度為8.25×10-3μg/mL的定量下限(Lower limit of quantitation，LLOQ)樣品。取氧化硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成氧化硝苯地平質(zhì)量濃度分別為66.67、33.33、6.67、3.33、6.67×10-1、6.67×10-2、6.67×10-3ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。另取一份氧化硝苯地平對照品儲備液適量，用甲醇稀釋配制成濃度為6.67×10-3ng/mL的LLOQ樣品。

2.1.4 質(zhì)控溶液的配制 取硝苯地平對照品儲備液適量，分別用甲醇稀釋，配制成硝苯地平質(zhì)量濃度分別為4.40、3.30、1.65×10-2μg/mL的QC溶液。取氧化硝苯地平對照品儲備液適量，分別用甲醇稀釋，配制成氧化硝苯地平質(zhì)量濃度分別為46.67、4.67×10-1、2.00×10-2ng/mL的質(zhì)控溶液。

2.2 血漿樣品的處理

2.2.1 對照品樣品處理方法 取空白血漿100 μL，加入硝苯地平對照品溶液25 μL，加入氧化硝苯地平對照品溶液10 μL，加入10.00 μg/mL尼群地平10 μL，1 mol/L氫氧化鈉100 μL，渦旋20 s，加入乙酸乙酯-正己烷(3∶1)混合液1 000 μL，渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min，取800 μL上清液，55 ℃水浴氮吹，吹干后用色譜甲醇150 μL復(fù)溶，渦旋20 s，14 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液進(jìn)樣100 μL。

中職學(xué)校的晚自習(xí)時間，很少能看到學(xué)生在教室里學(xué)習(xí)。其原因很多，除了學(xué)生缺乏學(xué)習(xí)動機(jī)、學(xué)習(xí)習(xí)慣未養(yǎng)成外，很可能與其學(xué)習(xí)風(fēng)格有關(guān)。在中職生群體中，獨(dú)立型學(xué)習(xí)風(fēng)格屬于被忽略的學(xué)習(xí)風(fēng)格，可見中職生不喜歡獨(dú)立、自主的學(xué)習(xí)方式，而喜歡合作與體驗(yàn)。

2.2.2 血漿樣品處理方法 取大鼠血漿樣品100 μL，加入10.00 μg/mL尼群地平10 μL、1 mol/L氫氧化鈉100 μL，渦旋20 s，加入乙酸乙酯-正己烷(3∶1)混合液1 000 μL，渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min，取800 μL上清液，55 ℃水浴氮吹，吹干后用色譜甲醇150 μL復(fù)溶，渦旋20 s，14 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液100 μL進(jìn)樣。

2.3 分析測定條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱Gemini 3 μm C18 110A(New Column 50×2.0 mm)，保護(hù)柱Security Guard Cartridges(GeminiC18 4×2.0 mm ID)，色譜柱與保護(hù)柱均購自phenomenex公司。柱溫(40 ℃)，流動相A：甲醇；流動相B：水，采用梯度洗脫，洗脫程序如表1所示，流速(0.6 mL/min)，取1 μL樣品進(jìn)樣分析。

表1 梯度洗脫條件

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子噴射電壓：-5 000 V；溫度：550 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力：55 psi；氣體2(GS2，N2)壓力：55 psi；氣簾氣體(CUR、N2)壓力：40 psi；正離子模式檢測；掃描模式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；定量離子對等質(zhì)譜條件如表2所示，硝苯地平、氧化硝苯地平、尼群地平對照品質(zhì)譜圖分別如圖1～3所示。

圖1 硝苯地平對照品質(zhì)譜

表2 質(zhì)譜條件

2.4 分析方法驗(yàn)證

2.4.1 專屬性 分別取6個來源不同的空白血漿100 μL，用等體積的甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液，按照“血漿樣品處理”項(xiàng)的方法操作，得色譜圖4A，取空白血漿，分別加入QC溶液，按“血漿樣品處理”項(xiàng)方法操作，得色譜圖4B～D，采集一只用藥1 h后的大鼠血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)操作，得色譜圖4E。圖4所示結(jié)果表明，氧化硝苯地平、硝苯地平和尼群地平的保留時間分別為2.35、2.52和3.02 min?？瞻籽獫{中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾硝苯地平、氧化硝苯地平和內(nèi)標(biāo)化合物的測定。

圖2 氧化硝苯地平對照品質(zhì)譜

圖3 尼群地平對照品質(zhì)譜

A：空白血漿；B：空白血漿+氧化硝苯地平對照品；C：空白血漿+硝苯地平對照品；D：空白血漿+尼群地平對照品；E：給藥大鼠生物樣品。

2.4.2 線性范圍 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項(xiàng)的方法處理標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。以血漿中分析物的理論濃度為橫坐標(biāo)，以分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程為標(biāo)準(zhǔn)曲線。硝苯地平典型線性方程為：硝苯地平的回歸方程Y=133.58×10-2X+0.08×10-2，R2=0.9 917。氧化硝苯地平典型線性方程為：Y=1.89×10-2X+0.09×10-2，R2=0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的測定濃度和理論濃度的相對誤差(RE)均不超過±15%，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，測定血漿中硝苯地平的線性范圍為8.25 ng/mL～5.27 μg/mL。氧化硝苯地平的線性范圍為6.67 pg/mL～66.67 ng/mL。

2.4.3 定量下限 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項(xiàng)方法處理LLOQ樣品，每個分析批共6個樣品，連續(xù)3個分析批。分別根據(jù)同批標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算LLOQ樣品的濃度，并計(jì)算其RE、批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、批間RSD，結(jié)果見表3、表4。所有LLOQ樣品所測定的濃度與理論濃度的RE在±20%之內(nèi)，且批內(nèi)、批間RSD不超過20%[7]。結(jié)果表明，本法測定血漿中硝苯地平的定量下限為8.25 ng/mL，氧化硝苯地平的定量下限為6.67 pg/mL。

表3 硝苯地平精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果

表4 氧化硝苯地平精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果

2.4.5 提取回收率 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項(xiàng)方法處理低、中、高3個濃度的QC血漿樣品，每個濃度6個樣品，進(jìn)樣所得峰面積分別除以空白血漿經(jīng)處理后再加入低、中、高6個濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)樣所得峰面積，即為血漿中硝苯地平和氧化硝苯地平的提取回收率。硝苯地平在低、中、高3個濃度血漿樣品中的提取回收率分別為(103.22±10.71)%、(105.84±8.24)%、(104.34±5.72)%，硝苯地平的相對回收率在103.22%～105.84%。氧化硝苯地平在低、中、高3個濃度血漿樣品中的提取回收率分別為(91.00±3.41)%、(101.27±9.31)%、(100.95±4.10)%，硝苯地平的相對回收率在103.22%～105.84%。

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng) 按“2.2.1 對照品樣品處理方法”項(xiàng)處理6個不同來源的空白血漿，分別加入低、中、高3個濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，每個濃度有6個樣品，進(jìn)樣所得峰面積記為A。以相應(yīng)濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣所得峰面積記為B。以不同來源樣品的面積A除以相應(yīng)濃度面積B的平均值，即為血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對硝苯地平、氧化硝苯地平和內(nèi)標(biāo)尼群地平的基質(zhì)效應(yīng)因子(Matrix factor，MF)。以硝苯地平、氧化硝苯地平與尼群地平MF的比值計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子，同時以多個樣品獲得的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子計(jì)算變異系數(shù)RSD。結(jié)果見表5，不同濃度測定結(jié)果的RSD均不超過15%，表明本方法可以忽略基質(zhì)對于樣品測定結(jié)果的影響[7]。

表5 硝苯地平及氧化硝苯地平基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

2.4.7 穩(wěn)定性 取硝苯地平23.75 μg/mL、89.06 ng/mL質(zhì)量濃度的QC樣品，每個濃度3個樣品。氧化硝苯地平630.00、0.27 ng/mL質(zhì)量濃度的QC樣品，每個濃度有3個樣品。分別考察含藥血漿室溫放置6 h，進(jìn)樣器下放置8 h，-80 ℃反復(fù)凍融3次，-80 ℃放置10 d的穩(wěn)定性。結(jié)果如表6、表7所示。

表6 硝苯地平樣品穩(wěn)定性結(jié)果

2.5 藥動學(xué)研究應(yīng)用

2.5.1 動物試驗(yàn)方案 將6只大鼠禁食不禁水12 h，次日灌胃給予硝苯地平的淀粉漿混懸液(給藥劑量為25 mg/kg)，分別于給藥后0.17、0.5、1、2、4、6、8、10、14、24、28、32、36 h于眼底靜脈叢取血0.3 mL，置于肝素涂壁的1.5 mL離心管中，3 500 r/min離心5 min，取上清液(血漿)于另一個離心管中，存放于-80 ℃保存。

2.5.2 未知樣品測定 按“血漿樣品的處理”項(xiàng)方法處理未知血漿樣品，每個分析批均隨行一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，均勻分布QC樣品。各分析批標(biāo)準(zhǔn)曲線中各濃度點(diǎn)和所有隨行的QC樣品的測定濃度與理論濃度之間的RE均在±15%之內(nèi)，并且直線回歸方程的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

2.5.3 藥動學(xué)參數(shù)計(jì)算及血藥濃度時間曲線 經(jīng)bapp 2.0軟件計(jì)算，藥動學(xué)參數(shù)見表8。6只大鼠分別灌胃給予硝苯地平及代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的平均濃度時間-曲線見圖5、6。

表8 藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果

圖5 硝苯地平平均血藥濃度-時間曲線

圖6 氧化硝苯地平平均血藥濃度—時間曲線

3 討論

文獻(xiàn)報道[8-11]，硝苯地平血漿樣品可通過加入乙腈、甲醇、乙醚、二氯甲烷-正己烷(3∶7)、乙酸乙酯等進(jìn)行前處理。由于生物樣品的血藥濃度較低，內(nèi)源性物質(zhì)易殘留，使用沉淀蛋白的方法不僅升高基質(zhì)效應(yīng)，還會縮短色譜柱的壽命[12]。本文通過按不同配比乙醚、乙酸乙酯、正己烷液液萃取法進(jìn)行血漿樣品前處理，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯-正己烷(3∶1)時，提取回收率高，對主峰無干擾，血漿雜質(zhì)少，重現(xiàn)性好。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了乙酸乙酯-正己烷(3∶1)進(jìn)行液液萃取來提取目標(biāo)物質(zhì)。通過液液萃取的方法，使檢測下限進(jìn)一步降低，提高了檢測方法對生物樣品的定量的適用性和精確性。另外由于目標(biāo)物為弱堿性[13-14]，故在液液萃取前堿化血樣，使藥物較多以非解離型存在，可增大提取物在有機(jī)相中的溶解度，從而提高回收率。由于生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)較多，故采用梯度洗脫的方法，通過梯度變換流動相(甲醇-水)的比例，保證在每次進(jìn)樣過程中，均可實(shí)現(xiàn)高比例水相和有機(jī)相的洗脫，從而改善峰型，減少拖尾，延長色譜柱壽命[15]。同時，在色譜柱前連接保護(hù)柱，可提高柱效，使測定結(jié)果更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠不同時間點(diǎn)取血進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)檢測，對比發(fā)現(xiàn)，眼眶取血法比心臟取血法在本實(shí)驗(yàn)中更具優(yōu)勢。心臟取血時，使用水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉，試驗(yàn)中存在弊端，如：大鼠需要5～10 min才能進(jìn)入麻醉狀態(tài)，在未麻醉狀態(tài)下取血困難，容易錯過最佳取血時間；麻醉劑量不易掌握，致死率較高；大鼠在麻醉后約0.5～1 h 蘇醒，嚴(yán)重影響大鼠的正常生理狀態(tài)，從而影響藥物代謝，難以獲得準(zhǔn)確、完整實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此本實(shí)驗(yàn)采取眼眶取血法，取血前用乙醚進(jìn)行麻醉，麻醉時間快，方法簡單，容易操作。用毛細(xì)管取血完成后，大鼠立即醒來，恢復(fù)正?；顒?、飲水、飲食，且死亡率低，并且能夠準(zhǔn)確掌控取血時間點(diǎn)，有利于獲取完整、準(zhǔn)確的血藥濃度數(shù)據(jù)。

文獻(xiàn)報道了CYP3A酶系是重要的藥物代謝酶，通過測定硝苯地平及其代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的血藥濃度，預(yù)測可能的藥物-藥物、藥物-食物相互作用[16-18]。本文建立的測定大鼠血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平血藥濃度的LC-MS方法具有專屬性強(qiáng)，靈敏度高，分析速度快的特點(diǎn)，可用于硝苯地平大鼠藥物代謝動力學(xué)研究。相對于其他研究[19-21]，硝苯地平的定量下限進(jìn)一步降低，可滿足生物樣本中血藥濃度測定的要求。同時，本研究建立了硝苯地平代謝產(chǎn)物氧化硝苯地平的血藥濃度測定方法，可更好地適應(yīng)以硝苯地平為探針研究藥物對肝藥酶活性影響及藥物相互作用研究的需要。