遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用

黃惻隱，李 林，聞偉鍔，李小妹，徐德林

(遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

我國具有豐富的中藥材資源，500多種常用中藥材已有近一半開展了人工種植，例如大宗藥材三七、丹參和當(dāng)歸已幾乎全部來源于栽培[1]。中藥材具有副作用相對較小、資源分布廣、價格適宜的特點，對疾病的整體診療以及對慢性病、疑難病癥也具有獨特的治療效果[2]。而通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可以實現(xiàn)中藥材品種改良，以及探究中藥材的藥用活性成分的分子合成機(jī)制，為中藥材產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提高技術(shù)支持。

植物遺傳轉(zhuǎn)化(Plant genetic transformation)是利用重組DNA技術(shù)和細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因?qū)胫参锘蚪M中使植物獲得新性狀的技術(shù)。遺傳轉(zhuǎn)化研究最早廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、番茄、擬南芥和煙草等經(jīng)濟(jì)作物和模式植物中，以改良植物品種和研究基因調(diào)控功能為目的。隨著人們對中醫(yī)藥促進(jìn)健康的重視，以及滿足民族中藥材產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的需求，生產(chǎn)出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的中藥材是發(fā)展中藥材產(chǎn)業(yè)的基本物質(zhì)保障。研究調(diào)控中草藥生長發(fā)育和藥用活性成分合成積累的遺傳機(jī)制，推進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、代謝工程等生物技術(shù)在中藥材研究中的應(yīng)用是大勢所趨，也是促進(jìn)中藥材產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化升級的必經(jīng)之路。然而，目前很多藥物植物仍存在轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用少和進(jìn)展緩慢的情況。

借助在模式植物上的成熟研究思路和技術(shù)方法，通過解析調(diào)控植物生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成的代謝機(jī)制，改良藥用植物品種和提高其藥用活性成分合成積累的目的[3-4]。本文綜述了近年有關(guān)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用，探討了該技術(shù)在藥用植物研究中尚存在的主要問題，并對技術(shù)的發(fā)展趨勢與進(jìn)一步應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為中草藥的生長發(fā)育規(guī)律揭示與藥用活性成分的合成生物學(xué)研究提供借鑒。

1 植物遺傳轉(zhuǎn)化方法與影響因素

植物遺傳轉(zhuǎn)化是利用細(xì)胞組織培養(yǎng)和基因克隆等技術(shù)，有目的地將外源基因插入植物基因組中獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)[5-6]。遺傳轉(zhuǎn)化方法包括基因槍法、電擊法、超聲波法、顯微注射法、PEG法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和DNA病毒載體介導(dǎo)法。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和花粉管通道法在植物中應(yīng)用最為廣泛[7-8]，這3種遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)缺點和影響因素存在明顯差異(見表1)。在這3種方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的影響因素較多，不僅對遺傳轉(zhuǎn)化受體有較高的要求，還需構(gòu)建起系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但該方法存在靶點性更明確，更有助于目標(biāo)基因功能實現(xiàn)的優(yōu)點，更適用于中草藥中遺傳背景較清晰的單個或少數(shù)基因的功能分析。而基因槍法的靶向性較弱但轉(zhuǎn)化率高，可適用于幾乎全部的藥用植物。花粉管通道法受到更多的非人為因素影響，重復(fù)性和轉(zhuǎn)化率均較低，在藥用植物中的應(yīng)用易受限制。盡管如此，3種方法均被成功應(yīng)用于藥用植物的研究中。

表1 三種遺傳轉(zhuǎn)化方法的比較

1.1 遺傳轉(zhuǎn)化方法在藥用植物中的應(yīng)用 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediated transformation method)是通過農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞的過程中將外源基因整合到農(nóng)桿菌質(zhì)粒上的T-DNA，再通過T-DNA插入到受體植物基因組中獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法，由于其轉(zhuǎn)化方法具有操作簡便和轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點，因此在植物遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較多[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將川烏Ac-F3'5'H基因轉(zhuǎn)化到矮牽牛中，發(fā)現(xiàn)該基因可催化合成藍(lán)色花色素[10]。在鐵皮石斛甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶2基因的功能研究中，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)化到煙草中，發(fā)現(xiàn)煙草中的谷甾醇含量得到了顯著提高[11]。

基因槍法(Gene gun bombardment)是將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒的表面，利用加速裝置將微粒射入受體細(xì)胞，而微粒上的外源DNA將隨機(jī)整合到受體細(xì)胞的基因組中，從而實現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)化的方法[12]。王瑛等[13]通過基因槍法將大麥lea3基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿的胚性愈傷組織中，從而獲得了具有較強耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株。由于基因槍轉(zhuǎn)化法存在成本高、不利于外源基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的特點，使得其在藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究較少。

花粉管通道法(Genetic transformationviapollen-tube pathway)是授粉后使外源的基因沿著花粉管進(jìn)入胚囊后轉(zhuǎn)化受精卵細(xì)胞，從而將外源基因整合到植物基因組中的方法[14]?；ǚ酃芡ǖ婪ù嬖诓僮骱啽?，縮短育種時間，可用于所有開花植物的優(yōu)點；但也存在受環(huán)境影響大，易形成多位點整合的缺點，使得其在藥用植物的研究也較少[15]。在荔枝的轉(zhuǎn)基因育種研究中，王樹軍等[16]首次將花粉管通道法成功應(yīng)用于荔枝中的外源基因轉(zhuǎn)化。

1.2 遺傳轉(zhuǎn)化影響因素 植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，轉(zhuǎn)化效率受多種環(huán)境狀況和培養(yǎng)條件等因素的影響，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和花粉管道法的影響因素存在著差異。

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的影響因素 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的物理影響因素包括培養(yǎng)基pH值、溫度、光照、水分，化學(xué)影響因素包括培養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)劑、表面活性劑，其他影響因素有農(nóng)桿菌菌株類型、侵染濃度、侵染時間、抗生素濃度、宿主類型、受體基因型和受體生長狀態(tài)等，這些因素都與轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)[17-18]。在紅腺忍冬的遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，葉片是最適宜外植體，30 mg/L是抗生素頭孢霉素的最適宜濃度[19]。姜育松等[20]在研究鉤藤發(fā)根的高效誘導(dǎo)體系中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌C58C1對其莖、嫩葉和老葉3種外植體的誘導(dǎo)率都超過了80%，其中嫩葉最高達(dá)到了91.8%，同時發(fā)現(xiàn)B5培養(yǎng)基最適于鉤藤發(fā)根的生長和2種生物堿的積累。在丹參遺傳轉(zhuǎn)化研究中，張林甦等[21]優(yōu)化了丹參葉片和莖快速誘導(dǎo)愈傷組織生成的培養(yǎng)基配方，以及愈傷組織生根的培養(yǎng)基配方，建立與優(yōu)化了以10 mg/L鏈霉素為篩選劑通過農(nóng)桿菌GV3101侵染5 min、共培養(yǎng)1 d的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。劉閔豪等[22]在研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中，篩選出了愈傷組織誘導(dǎo)不定芽和不定芽復(fù)壯的最適培養(yǎng)基配方，確定了預(yù)培養(yǎng)5 d、侵染10 min、共培養(yǎng)3 d以及3/4 MS+0.054 μmol/L NAA+4.4 μmol/L 6-BA+200 mg/L Cef+70 mg/L Km為篩選培養(yǎng)基的高效丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系。不同物種的各階段培養(yǎng)方式以及提高遺傳轉(zhuǎn)化率的過程都存在差異，但可發(fā)現(xiàn)在植物愈傷組織侵染中時間不宜太長，過長可能抑制愈傷組織增殖和分化，共培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行篩選培養(yǎng)，篩選過程中需添加適宜濃度的篩選劑和抑制農(nóng)桿菌的抗生素，這些都是建立與優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵影響因素。

1.2.2 基因槍法的影響因素 基因槍法的影響因素包括受體類型、轟擊前后培養(yǎng)條件、基因槍的轟擊參數(shù)、DNA濃度、DNA沉淀劑、微彈用量、微彈速度、微彈射程、培養(yǎng)基成分等，這些因素都影響著其轉(zhuǎn)化的效率[7]。陳禹先等[23]對微載體的選擇、制備、包埋、點膜和轟擊參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并對抗生素選擇培養(yǎng)基和受體細(xì)胞處理等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，顯著提高了微藻的遺傳轉(zhuǎn)化效率。在蛹蟲草通過基因槍法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，以金粉包裹載體pDHt-gpd A-GFP-bar，在靶距離6 cm或9 cm，氦氣壓力7.58×106Pa或8.96×106Pa的條件下，經(jīng)草銨膦抗性篩選，成功獲得了2個遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子[24]?；驑尳閷?dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法受多種因素影響，其成本高和操作更為復(fù)雜，使得基因槍法的應(yīng)用在藥用植物中很少。

1.2.3 花粉管通道法的影響因素 花粉管通道法主要受外源基因轉(zhuǎn)化途徑、轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞和轉(zhuǎn)化時間等因素的影響，這些因素都與其轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)[25]。Agus等[26]通過組織化學(xué)和分子分析的方法研究了麻風(fēng)樹花粉管直接轉(zhuǎn)化的效率，發(fā)現(xiàn)不同基因型麻風(fēng)樹通過花粉管的轉(zhuǎn)化效率存在著差異。冼康華等[27]采用花粉管通道法對鐵皮石斛進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)以含有GFP和GUS基因的質(zhì)粒為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以獲得更高的結(jié)實率。在花粉管通道法介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，基因型和授粉時間等因素對轉(zhuǎn)化效率的影響至關(guān)重要，同時使用不同的載體也會得到不同的效果。

2 藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用概況

目前，遺傳轉(zhuǎn)化研究的藥用植物有黃連[28]、虎杖[29]、杜仲[30]、黑果枸杞[31]、流蘇石斛[32]和甘草[33]等，這些藥用植物的研究成果也為其他藥用植物開展遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了參考。現(xiàn)階段還有很多藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究尚未開展，已開展的研究中也是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛，利用其他遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化成功的報道還比較少。而藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究主要應(yīng)用于品種改良、基因沉默和代謝工程等主要領(lǐng)域。

2.1 品種改良 通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)能顯著提高藥用植物的產(chǎn)量、抗病性、抗蟲性、抗菌性和抗逆性等[34]，從而獲得品質(zhì)更好的轉(zhuǎn)基因植株[35]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法在藥用植物轉(zhuǎn)基因育種研究中也應(yīng)用成功，獲得了質(zhì)量更好和產(chǎn)量更高的中藥材優(yōu)良品種[36]。例如，張振華等[37]通過轉(zhuǎn)入抗病毒基因CyMB-CP到石斛中，優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為培育抗病毒石斛新品種提供了材料基礎(chǔ)。邱璐等[38]用基因槍法將水稻RBBI2-3基因轉(zhuǎn)移到燈盞花中，并對其遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，成功獲得了具有較強抗蟲和抗真菌的燈盞花轉(zhuǎn)基因植株，提高了花的產(chǎn)量和品質(zhì)。Zeng等[39]在花椒中建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的再生和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為進(jìn)一步進(jìn)行品種改良和基因功能分析奠定了良好的基礎(chǔ)。Azadi等[40]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將無毒的黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)入百合中獲得了CMV抗性很強的百合植株。Zhang等[41]將一個NAC轉(zhuǎn)錄因子CcNAC1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法整合到黃麻的基因組中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CcNAC1的黃麻植株對干旱的耐受性顯著增強，從而鑒定出了CcNAC1為干旱脅迫耐受性的正調(diào)控因子。

2.2 基因沉默 基因沉默(Gene silencing)是生物體內(nèi)特定基因的不表達(dá)或者表達(dá)降低的現(xiàn)象。RNA干擾廣泛存在于生命體中，是一種在轉(zhuǎn)錄后水平上的序列特異性基因沉默，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥用植物的代謝工程中可通過在生物和細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入小干涉RNA后引起同源mRNA的降解而使得目的基因沉默[42]。

amiRNA(Artificial microRNA)是一種誘導(dǎo)目的基因發(fā)生特異性沉默的技術(shù)，amiRNA在轉(zhuǎn)化植物中對目標(biāo)靶基因的沉默具有較高的特異性，人工設(shè)計出的不同amiRNAs在所轉(zhuǎn)化株系中的沉默效率也存在不同[43]。基因沉默主要應(yīng)用于探究藥用植物中關(guān)鍵基因的調(diào)控功能，以進(jìn)一步解析關(guān)鍵基因在生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成積累中的分子調(diào)控機(jī)制。王健等[44]選取丹參的1個R2R3 MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因SmPAP1為研究對象，設(shè)計并構(gòu)建相應(yīng)的amiRNA基因干涉載體對SmPAP1進(jìn)行特異性沉默，在陽性轉(zhuǎn)化株系中發(fā)現(xiàn)了與酚酸代謝途徑緊密相關(guān)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)顯著下調(diào)以及總酚酸含量下降的現(xiàn)象，進(jìn)一步說明了SmPAP1作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子參與了丹參酚酸類活性物質(zhì)的代謝調(diào)控。黃興琳等[45]通過構(gòu)建FAD3基因的RNA干擾表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到了紫蘇中，發(fā)現(xiàn)陽性植株中FAD3基因的表達(dá)受到了顯著抑制。在甘草阿魏酸5-羥化酶(Ferulate 5-hydroxylase，F(xiàn)5H)基因的研究中，通過前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)該基因在甘草酸生物合成中起負(fù)調(diào)控作用，以甘草胚軸為外植體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法誘導(dǎo)了F5H基因過表達(dá)和沉默毛狀根，UPLC檢測發(fā)現(xiàn)F5H基因沉默的毛狀根的甘草酸含量顯著提高，從而證實了F5H基因在甘草酸生物合成的負(fù)調(diào)控作用[46]。

2.3 代謝工程 植物次生代謝產(chǎn)物包括萜類、酚類和含氮化合物3類，廣泛參與了植物的生長、發(fā)育和防御等生理過程，在植物的生命活動過程中發(fā)揮著重要作用。藥用植物的有效成分大多是次生代謝產(chǎn)物，其含量很少，利用栽培措施很難提高其有效成分的含量，而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)和酶合成能有效提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成[47-48]。例如，陳塵等[49]在藥用植物丹參基因組中克隆丹參COI1基因并初步分析其蛋白特征及表達(dá)模式，進(jìn)而利用RNAi技術(shù)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了丹參COI1基因沉默株系，檢測發(fā)現(xiàn)丹參COI1基因參與調(diào)控了丹參主要次生代謝產(chǎn)物合成和積累的過程。Figlan等[50]通過不同的根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的毛狀根與丹參體內(nèi)生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生存在密切的相關(guān)關(guān)系。Ma等[51]通過克隆青蒿AaHDR1基因構(gòu)建過表達(dá)載體和反義抑制載體進(jìn)而獲得遺傳轉(zhuǎn)化的青蒿植株，發(fā)現(xiàn)AaHDR1基因的過表達(dá)增加了青蒿素、青蒿素B和其他倍半萜以及多個單萜的含量，而反義抑制其基因則導(dǎo)致了相反的結(jié)果，表明AaHDR1不僅促進(jìn)青蒿素的積累，也對其他萜類物質(zhì)的合成具有重要作用。Shi等[52]同時過表達(dá)ADS、CYP71AV1、ALDH1和CPR四個青蒿素生物合成途徑的基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，發(fā)現(xiàn)青蒿素的含量得到了顯著增加。

3 展望

藥用植物種類繁多，但受生長年限長和植株有效成分含量低的限制，藥用植物的產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢。藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化前期主要應(yīng)用于抗逆、抗病等研究，以提高產(chǎn)量和質(zhì)量為目的。而現(xiàn)在，藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化更多應(yīng)用于研究次生代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控機(jī)制，以實現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物在特定組織或細(xì)胞中的定向合成，也為后期的生物合成和化學(xué)合成提供理論基礎(chǔ)[53]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡便、成本低的優(yōu)點，使其在藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用較廣泛，但藥用植物仍存在轉(zhuǎn)化效率很低以及進(jìn)展緩慢的狀況，這都是目前亟待解決的問題。在藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用逐漸增多，該技術(shù)具有顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化體系高效性和穩(wěn)定性的優(yōu)點[54]。目前，基于磁性納米材料作為載體將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)也開始應(yīng)用，其納米材料對植物沒有傷害，也更有利于將外源基因轉(zhuǎn)入到植物基因組，有效提高了遺傳轉(zhuǎn)化的效率，而該技術(shù)在藥用植物中的應(yīng)用較少[55-56]。在基于磁性納米顆粒作為基因載體的棉花遺傳轉(zhuǎn)化研究中，發(fā)現(xiàn)在花粉中通過磁珠可以將外源基因成功導(dǎo)入到棉花基因組中，并建立了在棉花、辣椒和南瓜的子代中也穩(wěn)定表達(dá)的高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[57]。納米材料具有較高的轉(zhuǎn)化效率、良好的生物相容性、對外源基因的充分保護(hù)以及較強的植株再生的潛力[58]。因此，基于磁性納米顆粒的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥用植物中將具有很大的應(yīng)用前景。

基因工程技術(shù)在改良藥用植物、豐富藥用植物種質(zhì)資源以及提高藥用活性成分含量的研究中有著良好的發(fā)展前景。而且，藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展也將推動植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用活性成分的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本綜述對藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)梳理，以期對中藥材資源的合理開發(fā)利用、藥用活性成分代謝途徑的解析和藥活性成分的定向合成提供理論基礎(chǔ)。