基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效編輯小鼠miR let-7a

周 嵐，張生貴，胡祖梁，王添賢， 岳鵬鵬，于鴻浩*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院 細(xì)胞與遺傳學(xué)教研室，廣西 桂林 541104；2.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 放射科， 廣西 桂林 541199)

miRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，長約20～25個核苷酸，可以對基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后過程進(jìn)行調(diào)控。它們通過堿基互補(bǔ)結(jié)合靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated regions,UTRs)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)[1-2]。let-7家族作為最早被發(fā)現(xiàn)的miRNAs之一，在人體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等多個生物學(xué)現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。let-7a是let-7家族中重要的成員，let-7a作為一種抑癌基因在乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、肺癌[5]、鼻咽癌[6]以及口腔鱗癌[7]中表達(dá)顯著下調(diào)，并且在乳腺癌和肺癌中，患者的生存時間與let-7a的表達(dá)水平呈正相關(guān)。由此可見，let-7a在多種腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用，是一種關(guān)鍵的腫瘤發(fā)生調(diào)控 miR，但其功能異常在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，本研究為后續(xù)探討let-7a基因突變對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用提供了基礎(chǔ)，同時也為治療癌和let-7a作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠N2a細(xì)胞、sgRNA表達(dá)質(zhì)粒、Cas9表達(dá)質(zhì)粒(上?？萍即髮W(xué)黃行許教授惠贈)，大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒(康為世紀(jì)公司)，BsaⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。InvitrogenTMLipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、殺稻瘟霉素和嘌呤霉素(Thermo Fisher Scientific 公司)。TransDirect? Animal Tissue PCR Kit試劑、Trans2K? Plus DNA Marker、EasyTaq? DNA Polymerase試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，pMDTM19-T Vector Cloning Kit試劑(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)。序列合成和測序均由廣州擎科生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建PGL3-sgRNA的重組質(zhì)粒：雖然人和小鼠兩個物種let-7a的成員組成及染色體定位上有所不同，但脊椎動物中l(wèi)et-7a家族成員的序列高度保守，表明不同物種中l(wèi)et-7a的功能也是保守的。

小鼠let-7a的編碼位點有兩個,分別是let-7a-1和let-7a-2，位于13號染色體和9號染色體。利用miRNAmap(http://mirnamap.mbc.nctu. edu.tw/index.php)和Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html)在線數(shù)據(jù)庫，分析let-7a-1和let-7a-2的編碼序列。根據(jù)sgRNA設(shè)計原則利用軟件Vector NTI 11.5針對let-7a-1和let-7a-2各設(shè)計兩對dual-sgRNAs。分別為let-7a-1-M-sg1、let-7a-1-M-sg2、let-7a-1-M-sg3和let-7a-1-M-sg4；let-7a-2-M-sg1、let-7a-2-M-sg2、let-7a-2-M-sg3和let-7a-2-M-sg4。根據(jù)上述打靶位點，在合成特異靶向小鼠let-7a基因的 sgRNA 導(dǎo)向序列的 5′ 端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列，在反義鏈的 5′ 端添加黏性末端aaac。將合成的Oligo序列進(jìn)行退火反應(yīng)，形成雙鏈 DNA片段。將sgRNA雙鏈DNA片段與pGL3-U6-sgRNA-BsaⅠ連接，測序驗證正確后，提取獲得上述所需pGL3-U6-let-7a-sgRNA質(zhì)粒，詳細(xì)步驟參考已發(fā)表文章[8]。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物篩選：將小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a)培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2濃度，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)基2～3次，待其增殖至細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%后，胰蛋白酶消化，傳代種板至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h后，待6孔板中細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用InvitrogenTMLipfectamineTM3000試劑盒共轉(zhuǎn)染pGL3-U6-let-7a-sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表達(dá)質(zhì)粒，其中每孔轉(zhuǎn)染pGL3-U6-let-7a-1-sgRNA1(1.25 μg)、pGL3-U6-let-7a-1-sgRNA2(1.25 μg)、pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(2.5 μg)。留兩孔不轉(zhuǎn)染作為空白對照，轉(zhuǎn)染時基底液均為opti-MEN培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染 6 h 后用 PBS緩沖液清洗，換為DMEM完全培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后換液，并加入 12 μg/mL的嘌呤霉素和 110 μg/mL的殺稻瘟菌素進(jìn)行藥物篩選，直至對照組細(xì)胞大部分被藥物殺死且轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞仍大量存活時收取細(xì)胞，以獲得陽性的共轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞。

1.2.3 陽性細(xì)胞基因組DNA提取及打靶位點的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序：分別以上述4對dual-sgRNAs、Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的細(xì)胞裂解液為模板，進(jìn)行打靶位點DNA片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增體系為:模板 2 μL，dNTPs 2 μL，A+S(上下游引物) 2 μL，Easy Taq?DNA Polymerase 0.5 μL，10x Easy Taq?緩沖液2.5 μL,補(bǔ)充滅菌水至25 μL。其中l(wèi)et-7a-1引物的退火溫度為60.9 ℃，let-7a-2引物的退火溫度為56.8 ℃。引物序列見表1。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至擎科生物公司進(jìn)行Sanger法測序驗證。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.4 TA克隆測序分析：對測序結(jié)果顯示初步發(fā)生基因編輯的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化、重組DNA構(gòu)建(連接)、轉(zhuǎn)化和篩選獲得目的基因，連接的反應(yīng)體系為：pMD19-T質(zhì)粒載體0.5 μL，連接液solution Ⅰ 2.5 μL，PCR純化產(chǎn)物2 μL，16 ℃金屬浴1 h。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，經(jīng)過氨芐青霉素篩選得到陽性菌落，將菌液均勻涂布至LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)20 h后，挑取單克隆菌落，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，挑選陽性克隆菌落送測，測序結(jié)果與野生型序列比對分析，進(jìn)一步進(jìn)行基因分型。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA設(shè)計及PGL3-sgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計的4對dual-sgRNAs導(dǎo)向序列(表2)在let-7a上的靶序列符合 5′-N(21)GG排列規(guī)則，并且在let-7a上的靶序列是唯一的。按照上述方法所構(gòu)建的pGL3-U6-let-7a-sgRNA質(zhì)粒電泳圖(圖1)，質(zhì)粒大小與預(yù)期相符。表明sgRNA的表達(dá)載體成功。

表2 化學(xué)合成的sgRNA序列Table 2 Chemosynthetic sgRNA sequences

M.DL5000 DNA marker; 1.pGL3-U6-let-7a-1-M-sgRNA1 plasmid;2.pGL3-U6-let-7a-1-M-sgRNA2 plasmid;3.pGL3- U6-let-7a-1-M-sgRNA3 plasmid; 4.pGL3-U6-let-7a-1-M-sgRNA4 plasmid; 5.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA1 plasmid; 6.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA2 plasmid; 7.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA3 plasmid; 8.pGL3-U6-let-7a-2-M-sgRNA4 plasmid圖1 let-7a表達(dá)質(zhì)粒電泳圖Fig 1 Electrophoretic image of let-7a expression plasmid

2.2 藥物篩選得到sgRNA-Cas9的陽性共轉(zhuǎn)染細(xì)胞

小鼠N2a細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pGL3-U6-let-7a-sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)過嘌呤霉素和殺稻瘟菌素藥物篩選52 h后，可見對照組細(xì)胞基本死亡，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞仍大量存活(圖2)。此時收取細(xì)胞進(jìn)行打靶位點PCR擴(kuò)增實驗及測序分析。

2.3 打靶位點PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序

打靶位點PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖3)，目標(biāo)條帶與用 SnapGene軟件計算出來的分子質(zhì)量大小基本一致，target-1 為658 bp，target-2 為562 bp，擴(kuò)增條帶清晰，擴(kuò)增效率較高，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果見圖4，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩個靶點位置均有套峰出現(xiàn)，說明靶點位置存在不同的DNA序列，初步表明發(fā)生了基因編輯打靶成功。

the two control groups’ cells were treated with the same method as blank control of let-7a-1 and let-7a-2 targeting sites respectively; the remaining four groups’s cells were con-transfected with corresponding pGL3-U6-let-7a-sgRNA and pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 expression plasmids respectively

M.DL5000 DNA marker; 1.let-7a-1 control group cells; 2.let-7a-1-sg1,2-Cas9 contransfection cells; 3.let-7a-1-sg3,4-Cas9 contransfection cells; 4.let-7a-2 control group cells; 5.let-7a-2-sg1,2-Cas9 contransfection cells; 6.let-7a-2-sg3,4-Cas9 contransfection cells圖3 打靶位點PCR擴(kuò)增電泳圖Fig 3 PCR amplification electrophoretic image of target sites

2.4 TA克隆測序結(jié)果及打靶效率分析

4個位點分別送測19、 16、 19、 19個菌落克隆，利用通用引物M13F進(jìn)行測序。測序結(jié)果與野生型序列對比分析(圖5～6)，在4對 sgRNA 導(dǎo)向序列發(fā)生了堿基的隨機(jī)插入、缺失、替換等突變，編輯效率分別為42.10%、62.50%、52.63%、47.37%。表明本研究所設(shè)計的sgRNA均可以介導(dǎo) Cas9 蛋白，能有效、特異性的切割靶點 DNA序列。

3 討論

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作用于真核細(xì)胞內(nèi)基因后，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生非同源末端連接(NHEJ)或者同源性定向修復(fù)(HDR)兩種修復(fù)途徑[9]。本實驗利用NHEJ修復(fù)途徑直接將斷裂的DNA雙鏈連接，但此修復(fù)方式會造成堿基的缺失，破壞基因開放閱讀框，使目的基因發(fā)生移碼或無義突變， 導(dǎo)致基因失活，從而實現(xiàn)基因敲除的目的[10]。為了進(jìn)一步提高let-7a基因敲除(KO)效率，探索在靶部位精確編輯DNA的可行性[11]，本實驗創(chuàng)新性的針對小鼠 miR分子let-7a的兩個編碼位點let-7a-1和let-7a-2各設(shè)計了兩對dual-sgRNAs，所導(dǎo)向的靶標(biāo)序列均發(fā)生了突變，突變類型以堿基缺失為主。得到了較高的打靶效率。

A.blue background represents let-7a-1-sg1,2 targeting sites; B.blue background represents let-7a-1-sg3,4 targeting sites; C.blue background represents let-7a-2-sg1,2 targeting sites; D.blue background represents let-7a-2-sg3,4 targeting sites

The red fonts are the targeting sequence, the green fonts are PAM structure, and the lowercase letters are mutant bases. “……” represents the unlisted base sequences.“-” indicates base deletions. “+” indicates base insertions. “→” indicates base substitutions. “# N” indicates the sequences number. “N/ N” indicates the proportion of the genotype in the number of TA clone sequences

The red fonts are the targeting sequence, the green fonts are PAM structure, and the lowercase letters are mutant bases. “……” represents the unlisted base sequences.“-” indicates base deletions. “+” indicates base insertions. “→” indicates base substitutions. “# N” indicates the sequences number. “N/ N” indicates the proportion of the genotype in the number of TA clone sequences

越來越多的研究證實，miR表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致進(jìn)行性和失控的腫瘤生長。根據(jù)靶基因的特定功能，miRNAs既可以是腫瘤抑制基因， 也可以是通過作用于靶基因的促癌基因。在腫瘤細(xì)胞中，高表達(dá)的miRlet-7a可以顯著抑制細(xì)胞增殖、侵襲、體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移[12]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，let-7a主要通過調(diào)控下游靶基因發(fā)揮抑癌功能，下游靶基因主要有K-RAS、HMGA2、EZH2、c-Myc等[13-14]，但目前miRlet-7a發(fā)揮腫瘤抑制作用的機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過CRISPR/Csa9 技術(shù)在細(xì)胞層面對let-7a進(jìn)行敲除， 為后續(xù)建立let-7a敲除小鼠模型，在個體水平上探討let-7a基因功能缺失對腫瘤發(fā)生的作用打下基礎(chǔ)。同時let-7a靶點的深入挖掘和作用機(jī)制的闡明對多種腫瘤的診斷、預(yù)測及治療具有重要的理論指導(dǎo)意義。