甘藍(lán)型油菜莫利CMS(Moricandia CMS)的種質(zhì)創(chuàng)制

陳 麗， 楊雯竹， 胡彩紅， 杜才富， 雷紹林

(1.貴州省油菜研究所， 貴陽 550081； 2.貴州省油料研究所， 貴陽 550006)

目前我國對(duì)油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用途徑主要有：細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)、細(xì)胞核雄性不育(GMS)、化學(xué)殺雄(CH)和自交不親和(self-incompatibility)等，其中細(xì)胞質(zhì)雄性不育因易于獲得全不育群體，有利于雜交制種而在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。常見的同源CMS有PolCMS、陜2 A CMS、NapCMS等；異源CMS有OguCMS、莫利CMS(MoricandiaCMS)、DiplotaxiscatholicaCMS、OxyrrhinaCMS等[1]，其中莫利CMS系統(tǒng)在印度芥菜型油菜生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用[2-3]。

莫利CMS是Kirti P B、Prakash通過將Moricandiaarvensis(MM, 2 n=28)與Brassicjuncea(AABB, 2 n=36)進(jìn)行體細(xì)胞融合(2 n=64,MMAABB),再用芥菜型油菜不斷回交，獲得的一種芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)[4-5],該胞質(zhì)不育系統(tǒng)屬于配子體不育，育性穩(wěn)定且未發(fā)現(xiàn)其他胞質(zhì)不良效應(yīng)，其雜交種可育花粉與不育花粉各占50% ，但可育花粉量足夠滿足正常結(jié)實(shí)，對(duì)雜種產(chǎn)量并無影響[6]。目前研究表明，線粒體基因orf108-atpA共轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致莫利CMS的雄性不育[7]，2015年Deepak等[8]將莫利CMS育性恢復(fù)基因定位在了A 09染色體，恢復(fù)基因的克隆工作仍在進(jìn)行中。

一直以來，由于OguCMS具有不育徹底、易于保持的明顯優(yōu)勢(shì)，是較理想的雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑[9-10]。然而由于國外專利保護(hù)，缺乏自有恢復(fù)源成為中國OguCMS 應(yīng)用的主要技術(shù)障礙。目前國內(nèi)關(guān)于莫利CMS在生產(chǎn)上應(yīng)用的研究鮮有報(bào)道。本研究通過將莫利CMS引入甘藍(lán)型油菜，創(chuàng)制一批甘藍(lán)型油菜莫利 CMS材料，豐富了甘藍(lán)型油菜不育胞質(zhì)類型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料主要有芥菜型油菜莫利 CMS商品雜交種F1代，2013年由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)涂金星教授提供；用于回交的甘藍(lán)型油菜為貴州省油菜研究所穩(wěn)定自交系材料；作為參照的甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜取自貴州省油菜研究所油菜種質(zhì)資源庫。

1.2 田間試驗(yàn)

以芥菜型油菜莫利CMS商品雜交種F1代為母本，以甘藍(lán)型油菜自交系LZ 18001、LZ 18010等作為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。繼續(xù)以獲得的F1代雜種為母本，以甘藍(lán)型油菜優(yōu)良自交系為輪回親本連續(xù)回交5～6代，獲得甘藍(lán)型油菜莫利CMS候選株系若干。結(jié)合花粉活力鑒定結(jié)果以及套袋自交結(jié)實(shí)情況對(duì)候選株系進(jìn)行回交、自交。同時(shí)對(duì)部分選育出的恢復(fù)系、不育系進(jìn)行了雜交和自交，鑒定其恢復(fù)性。

1.3 花粉活力測(cè)定

采用醋酸洋紅染色測(cè)定法。取油菜花3朵，將每朵花的花粉置于載玻片上，用1%的醋酸洋紅染色液染色后蓋上蓋玻片(切勿壓片)，在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)(統(tǒng)計(jì)300個(gè)以上花粉粒)，大而圓且著色深的為可育花粉，小而癟且著色淺的為不育花粉。計(jì)算可育花粉個(gè)數(shù)占所觀察花粉總數(shù)的百分比，用來衡量植株花粉育性。

1.4 胞質(zhì)分子標(biāo)記檢測(cè)

采用CTAB小樣法提取基因組DNA[11]。本研究選用3個(gè)基于莫利CMS不育基因設(shè)計(jì)的特異引物orf108-O、orf108-N、orf108-B對(duì)轉(zhuǎn)育的甘藍(lán)型油菜莫利CMS材料以及其他胞質(zhì)材料進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

表1 甘藍(lán)型油菜莫利CMS鑒定分子標(biāo)記引物序列Table1 Primer sequences for identification of Mori CMS in Brassica napus L. by molecular marker

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜莫利CMS不育系及恢復(fù)系材料的獲得

2013年秋播莫利CMS不育胞質(zhì)商品雜交種F1代，2014年3月花期選株以甘藍(lán)型油菜材料作為父本進(jìn)行第一輪去雄雜交，同年7月在貴州威寧縣夏繁進(jìn)行第一輪回交獲得BC1種子。從2015—2016年正季和夏繁每年回交2代。2017年3月對(duì)獲得的BC5F1代株系分單株進(jìn)行套袋自交和花粉鏡檢，同時(shí)繼續(xù)進(jìn)行回交和雜交。

不育株獲得：BC5F1中株系CGZ 909出現(xiàn)部分單株花粉活力小于3%，且套袋自交完全不結(jié)實(shí)(圖1 A)；其他單株花粉活力在30%～80%之間，套袋自交不同程度部分結(jié)實(shí)(圖1 B、C、D)。使用甘藍(lán)型油菜自交系LZ 18010、LZ 18018、LZ 18022等對(duì)各不育株進(jìn)行雜交，選擇母本自交完全不結(jié)實(shí)的單株雜交種繼續(xù)種植，并且對(duì)單株進(jìn)行花粉活力鑒定以及套袋自交結(jié)實(shí)情況觀察。結(jié)果顯，株系CGZ 909不育徹底，植株雜交后代表現(xiàn)為較低的花粉活力以及徹底的套袋自交不結(jié)實(shí)性(圖1 E)，其余株系不育株的雜交后代仍表現(xiàn)出不一致的花粉活力并且存在部分結(jié)實(shí)現(xiàn)象。于是將株系CGZ 909中不育株作為甘藍(lán)型油菜莫利CMS候選不育系。

注：A為CGZ 909-7,花粉活力1.5%；B為CGZ 909-15,花粉活力44%；C為CGZ 909-25,花粉活力57%；D為CGZ 909-6,花粉活力76%；E為CGZ 909-7雜交F1代,花粉活力2%。圖1 甘藍(lán)型油菜莫利CMS部分不育株結(jié)實(shí)及花粉活力情況Fig.1 Seed setting and pollen viability of some sterile plants of Mori CMS in Brassica napus L.

可育株獲得：株系CGZ 924、CGZ 925的大部分單株花粉活力在90%以上，且套袋自交結(jié)實(shí)正常；其余株系花粉活力在50%～90%之間，套袋自交包括正常結(jié)實(shí)、部分結(jié)實(shí)植株。對(duì)套袋自交結(jié)實(shí)正常的植株后代繼續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)株系CGZ 924、CGZ 925的自交后代花粉活力在90%以上、套袋自交完全可育(圖2)。于是將株系CGZ 924、CGZ 925作為甘藍(lán)型油菜莫利CMS候選恢復(fù)系。

注：A為甘藍(lán)型油菜莫利CMS不育株，花粉活力3%；B為甘藍(lán)型油菜莫利CMS株系CGZ 924可育株，花粉活力93%；C為甘藍(lán)型油菜莫利CMS F1代植株，花粉活力49%。圖2 莫利CMS在甘藍(lán)型油菜中三系配套Fig.2 Three lines of Mori CMS in Brassica napus L.

分別以株系CGZ 924、CGZ 925作為父本與株系CGZ 909進(jìn)行雜交，獲得的F1代單株花粉活力約50%，套袋自交結(jié)實(shí)正常(圖2)。表明實(shí)現(xiàn)了莫利 CMS在甘藍(lán)型油菜中的三系配套，且在甘藍(lán)型油菜中莫利 CMS仍表現(xiàn)為配子體不育的特點(diǎn)。

2.2 甘藍(lán)型油菜莫利CMS分子標(biāo)記輔助選擇

Gaikwad等[12]、Kumar等[13]的研究表明，在芥菜型油菜中莫利CMS不育的形成與orf108-atpA共轉(zhuǎn)錄相關(guān)。于是本研究根據(jù)orf108-atpA基因序列設(shè)計(jì)了3對(duì)引物(orf 108-O、orf 108-N、orf 108-B)，來對(duì)甘藍(lán)型油菜莫利CMS材料進(jìn)行篩選。

隨機(jī)選取甘藍(lán)型油菜莫利CMS株系CGZ 909、CGZ 924、CGZ 925材料各2株；甘藍(lán)型油菜常規(guī)材料10株(每5株等量混合，共2個(gè)混樣)、甘藍(lán)型油菜OguCMS材料10株(每5株等量混合，共2個(gè)混樣)、白菜型油菜5株(共1個(gè)混樣)、芥菜型油菜5株(共1個(gè)混樣)。用3對(duì)orf 108引物對(duì)其進(jìn)行特異性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物orf 108-O多態(tài)性較好(圖3 A)。再利用引物orf 108-O對(duì)甘藍(lán)型油菜莫利CMS及非莫利CMS材料進(jìn)行進(jìn)一步篩選(其中株系CGZ 909不育株30株、株系CGZ 924可育株30株、CGZ 925可育株30株、F1代可育株30株，甘藍(lán)型油菜常規(guī)材料10株、甘藍(lán)型油菜OguCMS材料10株、白菜型油菜5株、芥菜型油菜5株)。結(jié)果顯，引物orf 108-O在甘藍(lán)型油菜中對(duì)莫利CMS與其他系統(tǒng)材料有較好的區(qū)分度(圖3 B顯部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。

注：A為分子標(biāo)記初篩(1～2為甘藍(lán)型油菜莫利CMS不育株；3～6為甘藍(lán)型油菜莫利CMS可育株；7～8為甘藍(lán)型油菜常規(guī)材料；9～10為甘藍(lán)型油菜Ogu CMS材料；11為白菜型油菜；12為芥菜型油菜)，引物：orf 108-N、orf 108-B、orf 108-O；B為分子標(biāo)記orf 108-O篩選(1～16為甘藍(lán)型油菜莫利CMS不育株(S); 17～34為甘藍(lán)型油菜莫利CMS可育株(F);35～51為甘藍(lán)型油菜莫利CMS不育株與可育株雜交F1代;52～55為甘藍(lán)型油菜常規(guī)材料；56～59為甘藍(lán)型油菜Ogu CMS材料；60～61為白菜型油菜；62～63為芥菜型油菜)。圖3 甘藍(lán)型油菜莫利CMS胞質(zhì)分子標(biāo)記檢測(cè)Fig.3 Cytoplasmic molecular markers detection of Mori CMS in Brassica napus L.

3 結(jié)論與討論

本研究中所引入的莫利CMS系統(tǒng)在芥菜型油菜中表現(xiàn)為配子體不育類型。通過甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜莫利CMS的多代回交、自交轉(zhuǎn)育，發(fā)現(xiàn)莫利CMS系統(tǒng)在甘藍(lán)型油菜中也表現(xiàn)為配子體不育的特點(diǎn)。因此，花期肉眼無法分辨出不育單株，轉(zhuǎn)育過程中需通過單株套袋自交輔以花粉活力鑒定來對(duì)育性進(jìn)行辨別。研究表明，在早期轉(zhuǎn)育世代中，單純以套袋自交結(jié)實(shí)情況很難快速選育出不育性穩(wěn)定的株系。對(duì)轉(zhuǎn)育的不同株系進(jìn)行花粉活力鑒定，發(fā)現(xiàn)同為套袋自交不結(jié)實(shí)單株，花粉活力越低，其后代徹底不育株出現(xiàn)的概率越高。因此，選擇花粉活力低、套袋自交不結(jié)實(shí)的株系作為后續(xù)甘藍(lán)型油菜莫利 CMS不育系選育的基礎(chǔ)材料；花粉活力高、套袋自交正常結(jié)實(shí)的株系作為后續(xù)甘藍(lán)型油菜莫利 CMS恢復(fù)系選育的基礎(chǔ)材料。

目前常見的甘藍(lán)型油菜不育系統(tǒng)多為孢子體不育，配子體CMS不育株雖然與配子體不育株有著顯著區(qū)別，但正常胞質(zhì)可育株材料及其他不育系可育株材料很難在當(dāng)代花期與甘藍(lán)型油菜莫利 CMS系統(tǒng)材料進(jìn)行區(qū)分。育種實(shí)踐中為了防止育種材料的機(jī)械混雜，需在花期結(jié)束前對(duì)甘藍(lán)型油菜莫利 CMS材料的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行輔助鑒定。由于本研究所使用的原始材料為芥菜型油菜莫利 CMS商品雜交種F1代，因此其分離出的不育株和可育株材料均攜帶有導(dǎo)致胞質(zhì)不育的特有線粒體基因組。參考莫利 CMS在芥菜型油菜中的不育基因研究，根據(jù)orf108-atpA基因序列設(shè)計(jì)的引物orf 108-O對(duì)轉(zhuǎn)育材料進(jìn)行篩選，并獲得較好的區(qū)分效果。

本研究中獲得的甘藍(lán)型油菜莫利CMS材料CGZ 909、CGZ 924和CGZ 925將作為下一步莫利CMS親本選育工作的基礎(chǔ)材料。