實時三維斑點追蹤超聲心動圖聯合微小RNA 評估早期急性心肌梗死危險程度的價值△

陳小珠，黃鳳榮，劉運洪，劉淑軍，譚鋼文

（1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院超聲科，廣東深圳 518109；2.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院心內科，廣東深圳 518109；3.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518109）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者因發(fā)生急性冠狀動脈阻塞導致心肌缺血壞死，可引起相對應心肌的運動及功能受損。心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）等標志物是確診AMI 的“金標準”，然而這些標志物僅在AMI 急性發(fā)病前3～6 h 會升高，預警時效性不足，臨床上多半不能在患者急性發(fā)病前通過這些指標進行及時的判斷和做出干預。因此，尋找預警時效更早的診斷方法很有必要。實時三維斑點追蹤超聲心動圖（real-time three dimensional speckle tracking echocardiography，RT3D-STE）評估非透壁梗死和透壁梗死的左心室應變有差異［1-2］。在心肌損傷釋放出cTn 之前，三維（3D）左心室應變就開始下降，隨疾病進展，可出現左心室不良重構［3-4］。大量研究表明，微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）在心肌梗死后的細胞凋亡、血管生成以及梗死后的心肌修復中起到關鍵作用［5］。由于miRNA 是調控性RNA，在疾病早期即有顯著變化，現有研究證實，miRNA 的不同亞型在AMI 出現了不同程度的上調或下調，是極具診斷潛能的生物標志物［6］。因此，本研究應用RT3D-STE 檢查和外泌體miRNA 檢測，研究其在評估早期AMI 危險程度中的價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2021 年7 月入住深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院并行冠狀動脈造影（coronary angiography，CAG）的40 例AMI 患者為研究對象，其中男34例，女6例，年齡（52.9±10.63）歲。所有入組的AMI 患者均為首次發(fā)作。本研究經深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，已取得所有入選者的知情同意，并簽署知情同意書。AMI 診斷符合2018 年“心肌梗死全球統一定義”的診斷標準［7］，排除了患有心房顫動、外傷、腦卒中、急性感染、合并自身免疫病、嚴重肝及腎功能障礙、惡性腫瘤等疾病的患者。另選同期于深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院參加體檢的20 名健康者為對照組（正常組），其中男17 例，女3 例，年齡（50.05±4.80）歲。收集所有研究對象的臨床基礎資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、原發(fā)性高血壓（高血壓）病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、胸痛史、Killip 分級；生化指標檢查：血脂、血糖、腎功能、心肌酶及心肌二項［肌紅蛋白（myohemoglobin，MYOG）、cTnI］。

1.2 實時三維斑點追蹤超聲心動圖檢查

所有AMI 患者均在行CAG 后24 h 內，由一名專職醫(yī)生進行RT3D-STE 檢查。采用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，4V 矩陣探頭，頻率1.5～4.0 MHz，4DAutoLVQ 分析軟件。所有受檢者均取左側臥位，同步記錄心電圖，先進行常規(guī)二維超聲檢查，然后在標準心尖四腔觀采集單一心動周期左心室三維容積動態(tài)圖像。啟動4DAutoLVQ 分析軟件并按步點擊，軟件自動計算出左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）、左心室每搏輸出量（left ventricular stroke volume，LVSV）、左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心排血量（cardiac output，CO）、球形指數（spherical index，SpI）及左心室質量（left ventricular mass，LVMass），并獲取三維左心室整體長軸應變（three-dimensional global long axis strain，3D-GLS）、環(huán)周應變（threedimensional global circumferential strain，3D-GCS）、徑向應變（three-dimensional global radial strain，3DGRS）及面積應變（three-dimensional global area strain，3D-GAS）和17 節(jié)段縱向應變（segmental longitudinal strain，SLS）、環(huán)周應變（segmental circumferential strain，SCS）、徑向應變（segmental radial strain，SRS）、面積應變（segmental area strain，SAS）的彩色編碼牛眼圖，見圖1（A-D）。

圖1 同一AMI 患者（男，53 歲）的RT3D-STE 圖像（A：LVEF 為62.64%、SpI 為0.31，心內、外膜心肌質量為141 g、143 g；B：長軸應變，顯示3D-GLS 及17節(jié)段LS；C：面積應變，顯示3D-GAS 及17節(jié)段AS；D：徑向應變，顯示3D-GRS 及17節(jié)段RS）

1.3 分組及miRNA 檢測方法

由心血管內科醫(yī)師依據所有AMI 患者的CAG結果在SYNTAX 自有網在線計分，將SYNTAX 評分≥23 分且“罪犯血管”為近端閉塞者分為高危組，將SYNTAX 評分＜23 分且“罪犯血管”為中遠端閉塞者分為低危組，每組各20 例。所有AMI 患者在CAG 前采集外周血血清存儲，為了防止誤差，在所有樣本收集完畢后，選取20 例集中進行外泌體miRNA 測序（由深圳市承啟生物科技有限公司根據合同承擔）。高質量的reads 去接頭后，使用FANSe3 序列比對算法［8］向人類成熟miRNA 參考序列上比對，以每百萬讀數的轉錄本（transcripts in million，TPM）對miRNA 進行定量標準化。使用edgeR［9］算法進行差異表達分析。上調或下調超過2 倍的miRNA，且錯誤發(fā)現率（FDR）＜0.01 被定義為顯著差異表達的miRNA。分別與CAG 分組結果、三維左心室應變參數進行相關分析。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件統計分析。正態(tài)分布計量資料以（）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，3 組間比較用單因素方差分析。偏態(tài)分布的計量資料采用中位數［M（Q1～Q3）］表示，組間比較采用非參數檢驗。分類變量采用［n（%）］表示，組間比較用卡方（χ2）檢驗。兩組間相關性分析采用Pearson 檢驗。繪制受試者工作特征（receptor operating characteristic，ROC）曲線分析應變指標對冠狀動脈閉塞病變的評估價值。以P≤0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高危組、低危組和正常組研究對象的臨床資料和生化指標比較

3 組研究對象的一般臨床資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；生化指標中高危組和低危組患者的心肌酶及心肌二項均顯著高于正常組，且高危組高于低危組，差異有統計學意義（P＜0.05）；3 組研究對象其余生化指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 3 組研究對象的臨床資料、生化指標及冠狀動脈病變比較 ［n=20，n（%），M（Q1～Q3），］

表1 3 組研究對象的臨床資料、生化指標及冠狀動脈病變比較 ［n=20，n（%），M（Q1～Q3），］

注：與正常組比較，**P＜0.01；與低危組比較，1）*P＜0.05

2.2 3 組研究對象RT3D 左心室一般參數比較

高危組患者RT3D 左心室一般參數與低危組、正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且LVEF低于50%；低危組患者的CO 及LVEF 比正常組低，差異有統計學意義（P＜0.001），其他參數與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 3 組研究對象RT3D 左心室一般參數比較 ［n=20，］

表2 3 組研究對象RT3D 左心室一般參數比較 ［n=20，］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與低危組比較，1）*P＜0.05

2.3 3 組研究對象RT3D 左心室應變參數比較

高危組患者的左心室應變參數（3D-GLS、3D-GCS、3D-GAS及3D-GRS）與低危組、正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.001）；3組研究對象的RT3D左心室應變參數差異變化程度為高危組＞低危組＞正常組，差異有統計學意義（P＜0.001），詳見表3。

表3 3 組研究對象RT3D 左心室應變參數比較 ［n（%），n=20，］

表3 3 組研究對象RT3D 左心室應變參數比較 ［n（%），n=20，］

注：與正常組比較，**P＜0.01；與低危組比較，1）**P＜0.05

2.4 受試者工作特征曲線分析結果

RT3D 左心室應變參數（3D-GLS、3D-GCS、3D-GAS 及3D-GRS）鑒別高危組與低危組的ROC曲線詳見圖2，診斷效能詳見表4，曲線下面積（area under the curve，AUC）由大到小依次為3D-GLS（0.908）、3D-GAS（0.894）、3D-GRS（0.874）及3DGCS（0.803）。以3D-GLS＝-9.31%為臨界值，其診斷敏感度為80%，特異度為90%。

圖2 整體應變參數高危組與低危組的ROC 曲線圖

表4 RT3D 應變參數診斷高危組的ROC 曲線分析結果 ［n=40］

2.5 RT3D 左心室應變參數區(qū)分高危組、低危組和正常組的效果分析

精細分析RT3D 左心室應變參數的GLS、GAS、GRS、GCS 4 個指標，每個指標都能顯著區(qū)分高危組、低危組和正常組，詳見圖3A；Mann-Whitney Utest 的P值，除了GAS 在高危組和低危組中為0.0011，其余均在10-5～10-8，詳見圖3B。將4 個指標做主成分分析，第一個主成分（PC1）占了91.73%的貢獻率，也能極顯著地區(qū)分開3 組，詳見圖3C（Mann-Whitney U-test，P＜10-5）。

圖3 左心室應變指標對高危組、低危組、正常組的區(qū)分效果（A：4 項指標對3 組的區(qū)分；B：對（A）中各組之間兩兩比較的Mann-Whitney U-test 結果；C 將4 個指標進行PCA 分析，取PC1 進行繪圖）

2.6 從外泌體miRNA 中尋找區(qū)分高危組、低危組和正常組的分子標志物

為了區(qū)分高危組和低危組，我們選取了以下的外泌體miRNA 篩選標準：（a）按差異程度排序在前200 名；（b）高危、低危組和正常組均差異有統計學意義；（c）Kendall correlation 絕對值＞0.5；（d）該miRNA 的量與RT3D 左心室應變指標的Pearson 相關系數均＞0.6。經此4 項條件的篩選，最終篩選出2 個外泌體miRNA：miR-3681-5p 和miR-152-5p，其與3D-GLS、3D-GAS、3D-GCS 呈負相關，與3D-GRS 呈正相關，Pearson 相關系數為0.69～0.83，詳見圖4。

圖4 左心室應變參數與miRNA 的相關性分析圖

2.7 miR-3681-5p 和miR-152-5p 是高效區(qū)分高危組、低危組和正常組的miRNA 標志物

使用實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）對miR-3681-5p 和miR-152-5p 進行驗證，以U6 為內參。高危組、低危組和正常組3 組各6 個樣本的qRTPCR 結果顯示，單個miR-3681-5p 即可完全區(qū)分3 組（P=0.0013，Kolmogorov-Smirnovtest）。miR-152-5p 不能有效區(qū)分低危組和正常組（P=0.32，Kolmogorov-Smirnovtest），但可以區(qū)分高危組和低危組（P=0.0013，Kolmogorov-Smirnovtest），詳見圖5。因此，miR-3681-5p 和miR-152-5p 很可能是高效區(qū)分3 組的miRNA 標志物。

圖5 miR-3681-5p 和miR-152-5p 的qRT-PCR 驗證圖

3 討論

隨著國家胸痛中心規(guī)范性的建設，及時對AMI 患者施行CAG 并開通閉塞的冠狀動脈血管，挽救缺血瀕死的心肌，已經大大提高了AMI患者的臨床救治效率。但是，對三支主要冠狀動脈病變伴近端閉塞的AMI 患者而言，往往因嚴重的心肌缺血壞死對心功能損傷嚴重，預后不良，即使進行了經皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary stent implantation，PCI）治療，其后出現主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）的危險性仍然很大，盡早識別判斷、盡早干預救治是減少MACE的關鍵［10-11］。本研究AMI患者分為高危組和低危組，能夠突出AMI 患者冠狀動脈病變的不同危險程度［12］。

RT3D-STE 可通過心臟全容積圖像獲取多個應變參數，克服了2D-STE 的平面依賴，有利于準確評價左心室心肌整體及局部功能，而三維應變?yōu)樾募≡谌S方向上應變的綜合，能更敏感地評估心肌功能。本研究應用RT3D-STE 評價AMI高危患者，結果顯示隨著冠狀動脈病變復雜程度的加重，高?；颊叩腟pI、CO、LVEF 顯著降低，三維應變參數異常嚴重，雖然3D-GLS、3D-GAS、3D-GCS 及3D-GRS 這4 個指標均能夠鑒別高?；颊?，但以3D-GLS 和3D-GAS 檢測高危患者的敏感性最強，以3D-GLS＝-9.31%為臨界值，敏感度為80%，特異度為90%。有研究顯示，AMI 患者如果在PCI 治療后持續(xù)存在明顯的心肌應變參數異常，特別是長軸方向運動異常，往往預后不良，容易出現PCI 治療后再發(fā)心肌梗死、再發(fā)心力衰竭、惡性心律失?；蛩劳龅萂ACE 事件［13］。因此，對超聲參數——SpI、CO、LVEF、3D-GLS 和3D-GAS顯著異常的的高?；颊哌M行長期（2.5 年）的隨訪，動態(tài)監(jiān)測上述指標，可以觀察其對MACE 或者生存率是否具有相關指導意義。

外泌體miRNA 是內源基因編碼的、長度約為18～22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA［14］，是調控特定基因翻譯的調控性RNA，其變化通常早于蛋白質的變化，而蛋白質的變化又早于病理損害的發(fā)生，因此，外泌體miRNA 理論上可以在病理損害尚未發(fā)生時即發(fā)生變化，從而進行極早期的預警。研究發(fā)現，在AMI 梗死邊緣和梗死區(qū)域的早期階段（6 h）存在多種miRNA 的異常表達，因此，miRNA可能作為潛在的心肌梗死診斷標志物［15-17］。本研究應用RPM 定量篩選出兩個miRNA，即miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p，相關分析發(fā)現miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 與3D-GLS、3D-GAS 及3D-GCS 呈負相關，與3D-GRS 呈正相關；使用qRT-PCR 對miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 進行驗證顯示，單個miRNA-3681-5p 即可高效完全區(qū)分高危組、低危組和正常組，miRNA-152-5p 可高效區(qū)分高危組和低危組。因此，miRNA-3681-5p 和miRNA-152-5p 很可能是高效區(qū)分高危組、低危組和正常組的miRNA 標志物。這些在國內目前尚未見到相關的研究報道。

綜上所述，本研究應用RT3D-STE 和miRNA評估AMI 的結果，可能對AMI 早期危險分層有一定指導作用，但還需進一步前瞻性實驗證實應用。高?；颊弋惓５某晠担⊿pI、CO、LVEF、3D-GLS 和3D-GAS）有望成為AMI 患者PCI 治療后隨訪MACE 或者生存率相關的評估指標。

利益沖突聲明：在此次研究過程中或得到的研究結果均未受到任何機構或生產商的影響。