多孔隙三維環(huán)境下細(xì)胞接種密度對血管平滑肌細(xì)胞增殖行為的影響△

劉 江，馮子倍，周嘉輝，吳岳恒，，林展翼

［1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510080；3.先進制造科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室（季華實驗室），廣東佛山528200］

血管平滑肌細(xì)胞是組織工程血管構(gòu)建最常用的種子細(xì)胞，足夠量的細(xì)胞可以帶來足夠量的細(xì)胞外基質(zhì)，因此，合適的接種密度是非常關(guān)鍵的成功因素之一［1］。適宜的細(xì)胞密度可以促進細(xì)胞間接觸的建立，維持合適的細(xì)胞表型［2］。既往貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，過高的平滑肌細(xì)胞接種密度很快因細(xì)胞接觸抑制機制導(dǎo)致增殖停滯，而過低的接種細(xì)胞密度可以因培養(yǎng)過程中細(xì)胞間接觸的減少，導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱及分泌細(xì)胞因子減少，不利于細(xì)胞增殖［3］。體外基于生物反應(yīng)器進行的組織工程血管構(gòu)建，需要使用多孔隙支架材料形成一定厚度的管狀結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞黏附在三維空間環(huán)境下進行長時間的培養(yǎng)［4］。這種三維空間培養(yǎng)環(huán)境與既往體外二維培養(yǎng)環(huán)境有明顯差別，合適的細(xì)胞接種密度在很大程度上將取決于種子細(xì)胞類型和支架材料特性等因素，培養(yǎng)過程中的細(xì)胞行為也將明顯不同于既往的二維培養(yǎng)的細(xì)胞［5］。本研究擬將采取3 種不同細(xì)胞的濃度在聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）支架材料上進行培養(yǎng)，觀察血管平滑肌細(xì)胞的形態(tài)變化、黏附情況、增殖速度和表型改變等影響，從而探究合適的密度區(qū)間，為后續(xù)的小口徑組織工程血管研究提供指導(dǎo)意見。

1 材料和方法

1.1 支架材料的處理和細(xì)胞接種

取人主動脈中層細(xì)胞，用貼塊法培養(yǎng)人血管平滑肌原代細(xì)胞，待細(xì)胞爬出后再進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含有F12k 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20% 胎牛血清（Corning）、100 U/mL 青霉素和鏈霉素（Gibco）。細(xì)胞在37 ℃和5% 二氧化碳中生長，細(xì)胞融合時傳代，使用3～6 代內(nèi)細(xì)胞。將PGA 支架在1 mol/L 氫氧化鈉溶液中浸泡1 min，并用無菌水洗滌兩次，75%酒精中浸泡2 h，然后在超凈工作臺上通風(fēng)1 h干燥。將PGA支架置于24孔板中，并把不同濃度的細(xì)胞懸液（1×105個/mL、1×106個/mL、1×107個/mL）接種到PGA 支架上。接下來，將孔板倒置4 h 使細(xì)胞黏附到PGA 支架上。然后，將含有細(xì)胞的支架置于6 孔板中進行后續(xù)培養(yǎng)。

1.2 掃描電鏡方法

將樣品在2.5%戊二醛溶液中固定10 min，用蒸餾水沖洗5 min，然后在70%、85%、95% 和無水乙醇中分別脫水5 min。然后將樣品在六甲基二硅氮烷中浸泡10 min 并風(fēng)干3 h。將干燥的樣品鍍金，并用掃描電子顯微鏡（Merlin Carl Zeiss Jena）觀察。

1.3 免疫熒光方法

將樣品浸入4%多聚甲醛中，然后用0.2%Triton×-100 透化5 min。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次后，在室溫下用鬼筆環(huán)肽（Proteintech）處理樣品20 min，然后用4′，6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific）封片。最后，使用熒光共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞活力測定方法

使用Cell Counting kit-8（CCK8）試劑盒測定來確定細(xì)胞的活力。將PGA 剪成0.25 cm× 0.25 cm的正方形，放入96 孔板中。材料處理后，將不同濃度的細(xì)胞懸液接種在支架上，然后將96 孔板倒置4 h 后，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)4 d 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 到含有10%CCK-8 試劑的培養(yǎng)基。反應(yīng)2 h 后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到另一96 孔板中，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量每個孔的吸光度值。

1.5 免疫印跡方法

從樣品中提取總蛋白，并通過電泳，轉(zhuǎn)膜，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，隨后用5% 牛奶封閉液進行封閉。一抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（CST，1∶1 000），α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（Proteintech，1∶1 000）、Calponin（Proteintech，1∶1 000）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Proteintech，1∶10 000）分別與PVDF 膜在4 ℃下孵育過夜。然后在4 ℃下與二抗一起孵育2 h。我們使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑檢測條帶，使用ImageQuant LAS 500 進行可視化。使用Image J 軟件計算每個蛋白質(zhì)條帶的強度，使用GAPDH 作為標(biāo)準(zhǔn)化參考。

2 結(jié)果

2.1 聚乙醇酸支架材料上不同接種濃度的血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)變化

PGA 支架材料為多孔結(jié)構(gòu)，可以營造出三維結(jié)構(gòu)（圖1）。將不同濃度的細(xì)胞接種在PGA 支架上，細(xì)胞的形態(tài)是不同的，細(xì)胞形態(tài)會根據(jù)支架形狀而發(fā)生變化。當(dāng)細(xì)胞懸液濃度為1×105個/mL時，接種后支架上的細(xì)胞大多數(shù)以單個球型存在，散落分布在支架各處，接種后可見有較多細(xì)胞從支架上掉落。當(dāng)細(xì)胞懸液濃度為1×106個/mL 時，支架上的細(xì)胞可以沿著支架爬行并伸展開來，成簇存在，接種后可見有較少的細(xì)胞從支架上掉落。當(dāng)細(xì)胞懸液濃度為1×107個/mL，細(xì)胞布滿整個支架孔隙中并將PGA 支架包裹起來，形成片層結(jié)構(gòu)，幾乎沒有細(xì)胞掉落（圖2）。

圖1 PGA 支架材料［A：PGA 支架材料的大體圖（標(biāo)尺：200 mm）；B：PGA 支架材料的掃描電鏡圖（標(biāo)尺：50 μm］

圖2 在支架材料上不同接種濃度的細(xì)胞形態(tài)變化及接種后細(xì)胞掉落情況［A、D、G：不同濃度的細(xì)胞懸液接種在支架上的掃描電鏡圖（標(biāo)尺：20 μm）；B、E、H：不同濃度的細(xì)胞懸液接種在支架上的免疫熒光圖，紅色為肌動蛋白，藍(lán)色為細(xì)胞核（標(biāo)尺：20 μm）；C、F、I：不同濃度的細(xì)胞懸液接種在支架上掉落在底部的細(xì)胞（標(biāo)尺：200 μm）］

2.2 聚乙醇酸支架材料上不同接種濃度的平滑肌細(xì)胞增殖速度和表型改變

從CCK8 的結(jié)果（圖3A）可以看出，當(dāng)細(xì)胞接種濃度為1×105個/mL 時，細(xì)胞一直處于增殖狀態(tài)，增殖速度較為平穩(wěn)；當(dāng)細(xì)胞接種濃度為1×107個/mL時，前3 d 的增殖速度較快，但到了第5 天時，增殖速度放緩；當(dāng)細(xì)胞接種濃度為1×106個/mL 時，細(xì)胞增殖速度最快，并在第5 天時，細(xì)胞總數(shù)超過了接種濃度為1×107個/mL 的組別。

PCNA 也是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，Western blot 檢測培養(yǎng)了4 d 的細(xì)胞也得到了相同的結(jié)果，其中細(xì)胞接種濃度為1×106個/mL 時，PCNA 的表達最多（圖3B）。與二維培養(yǎng)（control）的結(jié)果相比較，支架環(huán)境下血管平滑肌細(xì)胞收縮表型標(biāo)志物α-SMA 和Calponin 的表達較低，但不同接種濃度的細(xì)胞表型沒有明顯差異。

圖3 PGA 支架材料上不同接種濃度的平滑肌細(xì)胞增殖速度和表型變化［A：CCK-8 法檢測不同濃度的細(xì)胞在PGA 支架材料上的增殖速度；B：Western blot 檢測不同濃度的細(xì)胞在PGA 支架材料上的增殖和表型標(biāo)志物］

3 討論

小口徑組織工程血管移植物是未來自體血管移植最有希望的替代品之一，為全球組織工程界和血管外科學(xué)界研究的熱點難點，現(xiàn)已有了突破性進展［6］。作為組織工程血管培養(yǎng)三要素之一，支架材料模擬體內(nèi)血管中細(xì)胞外基質(zhì)黏附支撐作用，讓種子細(xì)胞沿著支架爬行生長［7］。與常用的培養(yǎng)皿等二維貼壁生長環(huán)境不同，支架材料形成的三維空間結(jié)構(gòu)為細(xì)胞創(chuàng)造出更多的生長空間，從而帶來細(xì)胞行為上的變化［8］。細(xì)胞接種作為細(xì)胞在多孔支架內(nèi)分布和附著的第一步，對隨后的細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌至關(guān)重要。一個成功的初始條件，即合適密度的種子細(xì)胞，有助于細(xì)胞在整個支架上快速增殖和均勻分布，并有利于組織工程血管的形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 組不同細(xì)胞密度的組別中，細(xì)胞密度較大組（1×107個/mL）從支架上掉落的細(xì)胞比例最少，但培養(yǎng)后期出現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象；細(xì)胞密度較小組（1×105個/mL）細(xì)胞可以長時間處于增殖狀態(tài)，但從支架上掉落的細(xì)胞較多；當(dāng)細(xì)胞密度介于二者之間（1×106個/mL）時，細(xì)胞一直處于增殖狀態(tài)，并在第5 天時細(xì)胞的總數(shù)可以超過了密度最大的組，接種后細(xì)胞掉落的數(shù)目也較少。

三維空間環(huán)境中，細(xì)胞形態(tài)不僅受到支架材料的影響，也受到細(xì)胞密度的影響。此外，細(xì)胞密度會影響細(xì)胞懸液的黏度，細(xì)胞數(shù)量越多其懸液黏度就會越高，接種于PGA 支架后細(xì)胞就不易掉落［9］。而較低的接種密度會減少培養(yǎng)中肌源性細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞接觸發(fā)生率，導(dǎo)致這些細(xì)胞的融合水平降低［10］。但當(dāng)細(xì)胞密度過高會造成空間擁擠導(dǎo)致接觸抑制，致密的組織會影響氧氣和養(yǎng)分的輸入。有研究表明，高密度的細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多生理相關(guān)的模型組織，但高密度對培養(yǎng)細(xì)胞完全成熟的能力有負(fù)面影響［11］。故應(yīng)綜合考慮細(xì)胞掉落情況（細(xì)胞接種效率）和接種密度對組織正常生長的影響來做出選擇。

血管平滑肌細(xì)胞的增殖往往伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，在組織工程血管培養(yǎng)的初期，細(xì)胞快速增殖不僅能使細(xì)胞迅速布滿支架材料，而且能夠促進血管平滑肌細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)來包裹支架和填充支架孔隙，從而形成致密的細(xì)胞層［12］。本研究中不同細(xì)胞培養(yǎng)密度的增殖率差異，主要通過CCK-8 和殖抗細(xì)胞核增原PCNA 分子水平差異來顯示。結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)密度影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況，這促使我們對細(xì)胞接種密度進行優(yōu)化選擇。

綜上所述，根據(jù)細(xì)胞增殖和細(xì)胞掉落情況，我們認(rèn)為1×106個/mL 到1×107個/mL 這樣一個血管平滑肌細(xì)胞接種密度區(qū)間，將有利于細(xì)胞在PGA支架材料所形成的多孔隙三維環(huán)境下生長和細(xì)胞外基質(zhì)分泌。同時，本研究將有助于我們進一步了解支架材料對細(xì)胞影響，為組織工程血管培養(yǎng)的改進提供參考依據(jù)。