血管內皮功能調節(jié)酶pCDH-Myc-UBR5分子克隆的構建

趙海靜，劉琪，金蕊，程龍，劉昱圻，陳韻岱*

(1解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2中國人民解放軍軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所，北京 100071；3中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心心血管病醫(yī)學部，北京 100048)

泛素蛋白連接酶E3組分N-識別蛋白5(ubi-quitin protein ligase E3 component N-recognin 5，UBR5)是果蠅增生盤的哺乳動物同源基因[1]，與細胞增殖、衰老及腫瘤的產生相關。UBR5參與細胞周期的調控，具有介導核糖體RNA成熟[2]、響應DNA損傷反應[3]等功能。以往的研究多聚焦在UBR5與腫瘤的相關性上，UBR5通過調控經典Wnt信號通路，以糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)依賴的方式泛素化β-連環(huán)蛋白(β-catenin)并上調其表達水平[4]。UBR5在乳腺癌、胰腺癌細胞中高表達[5]，并能促進胰腺癌、黑色素瘤等腫瘤的增殖和轉移[6,7]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，UBR5在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。UBR5能夠促進DNA的修復并維持內皮細胞的穩(wěn)態(tài)[8]，減輕線粒體DNA的損傷，并且能夠改善血管祖細胞的功能[9]，促進受損內皮細胞的修復。有報道UBR5-/-小鼠存在血管缺陷，并且發(fā)現(xiàn)在小鼠中動脈損傷可引起UBR5表達水平的降低[10]。因此UBR5可能與冠心病等心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展相關。為進一步探究UBR5在內皮細胞穩(wěn)態(tài)及心血管疾病中的作用，我們構建了人UBR5基因的真核表達質粒，利用人胚胎腎細胞(human embryonic kidney cells 293 SV40 LT，HEK293T)鑒定UBR5蛋白的表達，并證實了UBR5與血管生成調控蛋白先天性角化不良1(dyskeratosis congenita 1，DKC1)存在相互作用，為探究UBR5在心血管系統(tǒng)的生物學功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆重組載體pCDH-EF1-Myc-puro(pCDH-Myc)、pCDH-Flag-DKC1質粒、HEK293T細胞、人乳腺癌細胞(Michigan cancer foundation-7，MCF7)為軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所惠贈；高保真DNA聚合酶購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；限制性核酸內切酶(BamHⅠ及NotⅠ)購自美國紐英倫生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的引物合成及基因測序委托北京博邁德公司完成?；瘜W發(fā)光儀購自美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF7細胞及HEK293T細胞培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。當細胞約80%融合時1∶5傳代。

1.2.2 獲取目的基因 采用細胞總RNA提取劑提取MCF7細胞的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，反轉錄為互補DNA(complementary DNA，cDNA)。反轉錄第一步：5×基因組DNA清除緩沖液(5×gDNA eraser buffer)2 μl、基因組DNA清除劑(gDNA eraser)1 μl、mRNA模板≤1 μg、二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水補至10 μl，42 ℃ 2 min。反轉錄第二步：反轉錄引物混合物1 μl、5×反轉錄緩沖液4 μl、反轉錄酶混合物1μl、DEPC水 4 μl，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冷卻至4℃，獲得cDNA模板。

根據(jù)目的基因UBR5編碼區(qū)序列設計擴增引物。因UBR5編碼區(qū)長達8 397 bp，直接擴增難度較大，成功率較低，所以在4 566-4 587位堿基處將UBR5編碼區(qū)分為前后兩個片段分別擴增。兩基因片段進行PCR擴增的上下游引物分別為上游引物1(forward primer 1，F(xiàn)1)：5′-ATTTGTTAAGAAAGAGA-

GGATCCACGTCCATCCATTTCGTG-3′；下游引物1(reverse primer 1，R1)：5′-TGCTGATTGAGGTATACTTGCT-3′；上游引物2(forward primer 2，F(xiàn)2)：5′-GCAAGTATACCTCAATCAGCA-3′；下游引物2(reverse primer 2，R2)：5′-CTGCCCTCAGCGGCCGCCACAAAACCAAAATTCTTGGTCT-3′，其中片段1的下游引物R1與片段2的上游引物F2重疊互補，作為兩片段同源臂用以重組連接。分別以MCF7細胞的cDNA為模板， F1、R1及F2、R2為引物進行PCR擴增UBR5目的基因，條件為：95 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.5 min，29個循環(huán)；68 ℃ 10 min，冷卻至4 ℃。使用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，并回收目的條帶。

1.2.3 構建pCDH-Myc-UBR5重組質粒 使用限制性核酸內切酶BamHⅠ及NotⅠ將pCDH-Myc載體雙酶切。體系：10×酶切緩沖液5 μl、內切酶各1.5 μl、質粒1～2 μg、雙蒸水補至50 μl，37 ℃孵育5 h。酶切產物及目的基因使用瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的條帶。載體與目的基因重組(摩爾比1∶1)，體系為：2×克隆重組混合物5 μl，雙蒸水補至10 μl，50 ℃連接60 min。連接產物轉化至感受態(tài)細菌，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取多個單克隆菌落，通過菌液PCR及質粒酶切鑒定陽性克隆，并將陽性克隆送公司測序。

1.2.4 蛋白質印跡法(Western blotting)鑒定Myc-UBR5蛋白表達 HEK293T細胞轉染質粒pCDH-Myc-UBR5或pCDH-Myc(空白對照)。細胞樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳、濕轉、封閉后，使用Myc-辣根過氧化物酶(Myc-horseradish peroxidase，Myc-HRP)抗體(1∶3 000)于4 ℃搖床孵育過夜，顯影。

1.2.5 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)實驗 HEK293T細胞對照組轉染質粒pCDH-Flag-DKC1、pCDH-Myc，實驗組轉染質粒pCDH-Flag-DKC1、pCDH-Myc-UBR5。使用免疫共沉淀緩沖液裂解細胞樣品。免疫共沉淀緩沖液配方如下：50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液(pH值7.4)、1%聚乙二醇辛基苯基醚、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸溶液、150 mmol/L氯化鈉溶液、10%甘油、40 mmol/L β-巰基乙醇。樣品冰上裂解30 min，加入抗-Flag磁珠4 ℃孵育過夜。樣品SDS-PAGE電泳，經濕轉、封閉后，使用Myc-HRP抗體(1∶3000)及Flag-辣根過氧化物酶(Flag-horseradish peroxidase，F(xiàn)lag-HRP)抗體(1∶5 000)4 ℃搖床孵育過夜，顯影。

2 結 果

2.1 pCDH-Myc-UBR5重組質粒構建及鑒定

為鑒定pCDH-Myc-UBR5重組質粒是否構建成功，將兩段目的片段與線性pCDH-Myc載體連接重組，轉化至感受態(tài)細胞，對單克隆菌落行菌液PCR及酶切鑒定，將陽性克隆送公司測序。UBR5基因編碼區(qū)序列分為前后兩段分別擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳，在4 118 bp及4 295 bp處產生特異性條帶，與預期目的片段大小一致(圖1A)。使用F1、R1引物進行菌液PCR擴增，陽性菌落在4 118 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1B)。陽性菌液提取質粒并經BamHⅠ、NotⅠ雙酶切，出現(xiàn)兩條特異性條帶，與目的基因和載體大小相同，約為8 397 bp、7 095 bp(圖1C)。

將菌液PCR及酶切鑒定均陽性的菌落進行基因測序，測序結果與UBR5序列比對一致(圖1D)，證明UBR5正確插入到pCDH-Myc載體中。

圖1 pCDH-Myc-UBR5重組質粒構建及鑒定Figure 1 Construction and identification of pCDH-Myc-UBR5 recombinant plasmidA: gel electrophoresis of UBR5 gene PCR products. The UBR5 sequence was amplified into two fragments (fragment 1 of UBR5 and fragment 2 of UBR5), and the amplified products were identified by gel electrophoresis. B: gel electrophoresis of pCDH-Myc-UBR5 bacteria liquid PCR products.‘1-5′ were selected as the clone colonies, and ‘5′ were identified as positive colony. C: endonuclease identification of pCDH-Myc-UBR5. 1, recombinant plasmid pCDH-Myc-UBR5 after double enzyme digestion; 2, recombinant plasmid pCDH-Myc-UBR5 without enzyme digestion. D: pCDH-Myc-UBR5 partial sequence, after DNA sequencing. pCDH-Myc-UBR5: pCDH-EF1-Myc-puro-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; PCR: polymerase chain reaction; M: DNA marker DL15000.

2.2 Western blotting鑒定Myc-UBR5蛋白表達

為驗證pCDH-Myc-UBR5重組質粒能否在細胞內正確表達，將其轉染至HEK293T細胞中，Western blotting鑒定Myc-UBR5蛋白表達情況。與對照組相比，轉染pCDH-Myc-UBR5質粒的細胞在約309 ku處出現(xiàn)特異條帶(圖2)。

圖2 Myc-UBR5蛋白表達鑒定Figure 2 Expression of Myc-UBR5Myc-UBR5: Myc-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; pCDH-Myc: pCDH-EF1-Myc-puro; pCDH-Myc-UBR5: pCDH-EF1-Myc-puro-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5.

2.3 Co-IP檢測UBR5與DKCI的相互作用

UBR5與H/ACA核糖核蛋白復合物(H/ACA ribonucleoprotein complex，H/ACA RNP)存在相互作用[2]。為驗證Myc-UBR5與H/ACA RNP復合物催化蛋白DKC1存在相互作用，HEK293T細胞同時轉染pCDH-Myc-UBR5及pCDH-Flag-DKC1，經Co-IP實驗表明Myc-UBR5與Flag-DKC1在細胞內可能存在相互作用(圖3)。

圖3 UBR5與DKC1存在相互作用Figure 3 Interaction between UBR5 and DKC1HEK293T cells transfected with pCDH-Myc-UBR5 and pCDH-Flag-DKC1, and immunoprecipitated with anti-Myc beads. Western blotting was performed using anti-Myc and anti-Flag antibodies. UBR5: ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; DKC1: dys-keratosis congenita 1; HEK293T: human embryonic kidney cells 293 SV40 LT. IP: immunoprecipitation; IB: immunoblotting; pCDH-Myc: pCDH-EF1-Myc-puro; pCDH-Myc-UBR5: pCDH-EF1-Myc-puro-ubiquitin protein ligase E3 component N-recognin 5; pCDH-Flag-DKC1: pCDH-EF1-Flag-puro-dyskeratosis congenita 1.

3 討 論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是參與細胞信號傳導且具有高度選擇性的蛋白質降解途徑，是最為廣泛的蛋白質翻譯后修飾方式之一。作為蛋白質穩(wěn)態(tài)調節(jié)劑[11]，泛素化系統(tǒng)在維持細胞正常生理功能中有著至關重要的地位。UBR5屬于E6AP C末端同源(homologous to E6AP C terminus，HECT)E3泛素連接酶，主要負責識別特異性底物和泛素鏈拓撲結構[12]，能識別N-端規(guī)則通路[13,14]，與心臟發(fā)育、血管生成、DNA修復、減數(shù)分裂、神經發(fā)育等相關。UBR5在胚胎干細胞中高表達，其表達量隨細胞分化而降低[15]。UBR5參與維持DNA損傷后的泛素信號穩(wěn)態(tài)，可調控DNA損傷檢查點激酶2(checkpoint kinase 2，CHK2)的活性，參與細胞周期中DNA合成前期/DNA復制期(G1/S期)及DNA復制期(S期)DNA損傷檢查點的激活，及雙鏈DNA斷裂后DNA合成后期/細胞分裂期(G2/M期)的阻滯[16]，間接調節(jié)磷酸化H2A.X變體組蛋白(γH2A. X variant histone，γH2AX)的泛素化[17]，促進DNA雙鏈斷裂位點的修復，從而維持基因組穩(wěn)定。此外，UBR5還參與細胞的糖異生過程。高糖通過刺激磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PEPCK1)的乙?；訌娖渑cUBR5 HECT結構域的相互作用，從而促進PEPCK1的泛素化降解和細胞糖異生過程[18]。

隨著研究的深入，UBR5與心血管系統(tǒng)的相關證據(jù)逐漸浮出水面。UBR5通過修復DNA損傷維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)。Li等[8]發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者的肺動脈內皮細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)與UBR5的相互作用中斷，DNA損傷且內皮細胞穩(wěn)態(tài)喪失。UBR5與DNA損傷感應子存在相互作用[19]，可響應內皮細胞的DNA損傷反應。PPARγ/UBR5通路的激活能夠抑制線粒體DNA損傷，改善內皮祖細胞功能[9]。此外，UBR5還能結合并穩(wěn)定轉錄共激活因子心肌素，上調平滑肌特異性基因的轉錄，在血管發(fā)育中起關鍵作用[10]。然而，UBR5在維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)、調節(jié)血管功能及心血管相關疾病中發(fā)揮的作用仍不明確。

本實驗通過Co-IP發(fā)現(xiàn)UBR5與血管生成調節(jié)蛋白DKC1存在相互作用。DKC1可能通過直接激活缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的轉錄促進血管生成[20]。轉錄因子HIF-1α由缺氧激活，表達水平受氧濃度調控，并可以誘導下游靶基因血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。HIF-1α可以改善急性心肌梗死大鼠的心功能，提高心臟毛細血管密度[21]。DKC1增強HIF-1α的轉錄，靶向內皮細胞生長因子促進血管生成，改善心肌重構及心臟功能。目前UBR5調控內皮細胞穩(wěn)態(tài)，促進平滑肌細胞分化及參與血管生成方面的功能仍需后續(xù)實驗進一步研究。

本研究通過PCR技術克隆UBR5編碼區(qū)序列，經菌液PCR、酶切及測序鑒定，成功將UBR5插入到pCDH-Myc載體中。將pCDH-Myc-UBR5瞬轉至HEK293T細胞中，證實Myc-UBR5在細胞中成功表達。重組質粒具有生物學功能，Co-IP證實UBR5與血管生成調控蛋白DKC1存在相互作用，為下一步研究UBR5在心血管系統(tǒng)的功能奠定了基礎。