HO-1基因修飾的內(nèi)皮祖細胞對壓力負荷型高血壓大鼠心肌肥厚的治療作用

劉 慧，劉 聰，劉 靜，黨晶藝，任 何，劉 軍

(1 中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710032；2 中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科；*通訊作者,E-mail:24226008@qq.com)

高血壓是世界上最普遍的疾病之一，可導(dǎo)致心腎腦等靶器官損傷，心肌肥厚是高血壓導(dǎo)致心臟損害的重要病理改變[1]。醫(yī)學(xué)文獻中出現(xiàn)了多種假說來解釋高血壓和相關(guān)靶器官損傷的發(fā)病機制。其中，血管內(nèi)皮細胞的功能和結(jié)構(gòu)改變在高血壓相關(guān)靶器官損傷和不良心血管結(jié)局的發(fā)展中起著不可或缺的作用[2]。如何改善內(nèi)皮功能已成為心血管疾病治療的新思路。1997年Asahara等[3]首次揭示的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)最初被認為是一組來自骨髓的細胞，參與血管內(nèi)皮的生成和修復(fù)。此后，EPC生物學(xué)異常與心血管不良事件風(fēng)險升高之間的相關(guān)性被證實[4]，提示EPC受損可能是高血壓相關(guān)靶器官損傷的一種原因。高血壓后來被證實是冠狀動脈疾病患者EPC功能下降最重要的獨立預(yù)測因子[5]。EPC可轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細胞，外周血源性EPC可改善心肌缺血再灌注大鼠模型的內(nèi)皮功能，降低心肌梗死面積，促進心肌細胞存活[6]。但移植EPC是否可改善高血壓心肌肥厚目前尚不清楚。

高血壓引起的EPC黏附、遷移等能力下降是EPC移植中的重要瓶頸[7]，因此有必要通過分子生物學(xué)手段對移植前的EPC進行預(yù)處理，從而提高EPC移植的效果。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有影響細胞增殖、抗凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)血管生成等多項生理功能[8]。另外，HO-1具有分子量較小、底物在血液中分布廣泛、代謝產(chǎn)物CO易彌散等優(yōu)點?；谏鲜霰尘?，本研究推測在治療心血管疾病時，通過對EPC進行HO-1基因修飾可能有助于提高療效。已有文獻報道[9]，HO-1基因修飾的EPC促進后肢缺血大鼠模型缺血肢體的血管生成，HO-1基因修飾的EPC可能為下肢缺血性疾病提供一種新的有效治療策略[9]。因此，本研究觀察HO-1基因修飾的EPC對壓力負荷型高血壓大鼠心肌肥厚的治療作用，并初步揭示其分子機制，旨在探討高血壓心肌肥厚防治的新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 淋巴細胞分離緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；EGM-2MV培養(yǎng)基(美國Lonza公司)；Lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher Scientific)；蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；心鈉素(ANP)ELISA試劑盒(博輝生物科技(廣州)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；白介素-17(IL-17)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；PrimeScript RT試劑盒和SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)；NP-40裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA檢測試劑盒和ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；SDS-PAGE(北京康為世紀生物科技有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；一抗和二抗(美國Abcam公司)。

1.1.2 實驗動物 60只雄性無特定病原體(SPF)級SD大鼠(6～7周齡，體質(zhì)量200～250 g)和5只雄性SPF級SD大鼠(3～4周齡，體質(zhì)量60～80 g)由空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院功能性腦疾病研究所提供。所有大鼠在SPF級環(huán)境中于12 h/12 h光暗循環(huán)下飼養(yǎng)，不限制飲食。實驗前對大鼠進行1周的預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠EPC的分離、培養(yǎng)及鑒定 5只3～4周齡SD大鼠用3%戊巴比妥鈉以40 mg/kg的劑量麻醉，頸椎脫臼處死。分離大鼠四肢骨(尺骨、橈骨、股骨、肱骨、脛骨)。然后使用10 ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)反復(fù)吸取和沖洗骨髓腔。通過密度梯度離心法提取骨髓單個核細胞，骨髓懸液與大鼠淋巴細胞分離緩沖液混合并離心(1 900g，20 min)，收集單個核細胞并在含有10% FBS的EGM-2MV培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為37 ℃、5% CO2。培養(yǎng)72 h后，貼壁細胞為EPC，于上述相同條件下在新鮮內(nèi)皮生長培養(yǎng)基-2 MV(endothelial growth medium-2 MV，EGM-2MV)培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基。初代EPC達到80%匯合后傳代，收集第二代和第三代EPC進行鑒定和后續(xù)實驗。

通過流式細胞儀鑒定EPC。收集EPC并與FITC標記的內(nèi)皮祖細胞的標志物(CD34、CD133和KDR)抗體孵育，稀釋度均為1 ∶500。然后在BD FACSCalibur流式細胞儀上分析EPC。

1.2.2 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將EPCs分為對照組(未轉(zhuǎn)染)、pcDNA3.1-HO-1組(轉(zhuǎn)染含有HO-1過表達序列的pcDNA3.1質(zhì)粒)和pcDNA3.1-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照pcDNA3.1質(zhì)粒)，質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染前，EPC懸浮在含有10% FBS的EGM-2MV培養(yǎng)基中，并在6孔板中培養(yǎng)(每孔含有1.0×106個EPC和2 ml培養(yǎng)基)。達到約80%匯合后，使用Lipofectamine 3000將pcDNA3.1-HO-1或pcDNA3.1-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到EPC中，轉(zhuǎn)染48 h。然后通過RT-PCR和Western blotting檢測HO-1的mRNA和蛋白水平，并通過傷口愈合實驗評價EPC的遷移能力。

1.2.3 傷口愈合實驗 將1.2.2中提到的各組EPC(5×105個細胞)接種于24孔板中，達到100%匯合后，用200 μl無菌移液管尖端在24孔板中劃一條劃痕。PBS清洗去除游離EPC后，用無血清EGM-2MV培養(yǎng)液孵育24 h，用奧林巴斯倒置顯微鏡在100倍放大倍數(shù)下分別于0 h和24 h拍攝照片，并計算傷口愈合率。

1.2.4 壓力負荷型高血壓(POH)動物模型的制備 48只6～7周齡SD大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，仰臥固定，腹部碘伏消毒。然后腹中線左側(cè)0.5 cm處切開皮膚，露出左腎動脈上方的腹主動脈。將7號針與腹主動脈平行放置，用6-0號縫合線結(jié)扎腹主動脈，然后輕輕取下針頭并逐層縫合皮膚。12只假手術(shù)大鼠在不結(jié)扎腹主動脈的情況下進行相同的手術(shù)步驟。術(shù)后所有大鼠每天分別給予20萬單位青霉素，連續(xù)3 d。

1.2.5 動物分組及治療 建模后，將模型大鼠隨機分為假手術(shù)組、POH組、EPC組、pcDNA3.1-NC-EPC組和pcDNA3.1-HO-1-EPC組，每組12只大鼠。假手術(shù)組和POH組大鼠頸靜脈注射0.5 ml PBS，EPC組大鼠注射0.5 ml PBS重懸的EPC(2.0×103/ml)，pcDNA3.1-NC-EPC組大鼠注射0.5 ml PBS重懸的pcDNA3.1-NC-EPC(2.0×103/ml)，pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠注射0.5 ml PBS重懸的pcDNA3.1-HO-1-EPC(2.0×103/ml)，各組大鼠每周均注射1次，連續(xù)4周。治療4周后，分別檢測各組大鼠的血壓和血流動力學(xué)參數(shù)，通過HE染色和Masson三色染色分別測量心肌細胞直徑和纖維化程度，采用ELISA法檢測血漿ANP、血清SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平，采用比色法測定血清乳酸脫氫酶(LDH)水平，通過RT-PCR檢測心肌組織HO-1基因相對水平通過Western blotting檢測心肌組織HO-1蛋白表達量。

1.2.6 血壓和血流動力學(xué)參數(shù)測量 治療結(jié)束時，所有大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。收縮壓(SBP)通過美國BIOPAC MP160多導(dǎo)生理記錄儀測量。采用Visual Sonics Vevo 2100超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)進行超聲心動圖檢查，測量各組大鼠的左室射血分數(shù)(EF)、左室縮短分數(shù)(FS)。

1.2.7 組織病理學(xué)檢查 處死大鼠并分離心臟，用預(yù)冷的PBS沖洗。4%多聚甲醛固定左心室，石蠟包埋，制備4 μm厚的組織切片，通過HE染色和Masson三色染色分別測量心肌細胞直徑和纖維化程度。用Leica光學(xué)顯微鏡分析每個切片50個心肌細胞。所選心肌細胞呈圓形，位于心室壁心內(nèi)膜下層。使用Image Pro Plus 6.0軟件測量平均心肌細胞直徑，并作為心肌細胞肥大的指標。使用Image Pro Plus 6.0軟件計算每個切片的膠原面積百分比，表示為纖維化面積百分比。

1.2.8 血液生化指標的檢測 大鼠眼眶后靜脈叢采血，離心分離血漿和血清。采用ELISA法檢測血漿ANP、血清SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平，采用比色法測定血清乳酸脫氫酶(LDH)水平。

1.2.9 RT-PCR檢測HO-1基因相對水平 根據(jù)說明使用TRIzol試劑分離EPC和心肌組織總RNA，PrimeScript RT試劑盒用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒在ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)上進行qRT-PCR。通過2-ΔΔCt方法確定mRNA相對表達量。引物序列如下：HO-1正向：5′-ACAGAAGAGGCTAAGACCG-3′，反向：5′-CAGCCCTACTTGGTTAGAAT-3′；β-actin正向：5′-CCTTCCTGGGTATGGAATCCT-3′，反向：5′-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3′。β-actin作為內(nèi)參基因。

1.2.10 Western blotting檢測HO-1蛋白表達量 使用NP-40裂解液提取EPC和心肌組織總蛋白。用BCA檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將20 μl總蛋白與5 μl 5×蛋白上樣緩沖液混合，100 ℃下變性5 min。冰上放置10 min后，將25 μl蛋白溶液加入10% SDS-PAGE凝膠的泳道中，在100 V、4 ℃下電泳1.5 h，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。與5%的牛血清白蛋白孵育1 h后，將膜與以下一抗在4 ℃下孵育過夜：抗HO-1(1 ∶1 000)和抗β-actin(1 ∶5 000)。第2天，將膜與HRP標記的山羊抗兔IgG H&L(1 ∶1 000)室溫孵育2 h。然后使用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯影。使用Image J軟件進行光密度分析。β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。細胞實驗中每組6個重復(fù)，動物實驗中每組12個重復(fù)。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析及LSD事后檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPC的鑒定結(jié)果及轉(zhuǎn)染效率

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，內(nèi)皮祖細胞的標志物(CD34、CD133和KDR)在分離的EPC中呈陽性表達。轉(zhuǎn)染后，各組EPC中HO-1的mRNA和蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(mRNA：F=942.796，P<0.001；蛋白：F=4 472.320；P<0.001)。與對照組相比，pcDNA3.1-HO-1組HO-1的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05，見圖1)。

與對照組比較，* P <0.05圖1 EPC的鑒定及各組EPC中HO-1的表達Figure 1 Identification of EPCs and expression of HO-1 in EPC in each group

2.2 上調(diào)HO-1的表達對EPC遷移能力的影響

傷口愈合實驗結(jié)果顯示，各組EPC的遷移能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.909，P<0.001)；與對照組相比，pcDNA3.1-HO-1組的傷口愈合率顯著升高(P<0.05，見圖2)。

2.3 HO-1基因修飾的EPC對POH大鼠血壓和血流動力學(xué)參數(shù)的影響

與假手術(shù)組相比，POH組大鼠的SBP水平升高，而EF和FS水平降低(均P<0.05)。與POH組相比，EPC組、pcDNA3.1-NC-EPC組和pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的SBP水平均降低，而EF和FS水平均升高(P<0.05)。與EPC組相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的SBP水平降低，而EF和FS水平升高(P<0.05，見表1)。

表1 各組大鼠的SBP、EF和FS水平Table 1 SBP, EF and FS levels of rats in each group

2.4 HO-1基因修飾的EPC對POH大鼠心肌細胞直徑和心肌纖維化的影響

HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，POH組大鼠的心肌細胞直徑升高(P<0.05)；與POH組相比，EPC組、pcDNA3.1-NC-EPC組和pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的心肌細胞直徑均降低(P<0.05)；與EPC組相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的心肌細胞直徑降低(P<0.05，見圖3)。

圖3 各組大鼠心肌組織的HE染色 (×200)Figure 3 HE staining of myocardial tissues in rats in each group (×200)

Masson三色染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，POH組大鼠的心肌纖維化面積升高(P<0.05)；與POH組相比，EPC組、pcDNA3.1-NC-EPC組和pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的心肌纖維化面積降低(P<0.05)；與EPC組相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC組的心肌纖維化面積降低(P<0.05，見圖4)。

圖4 各組大鼠心肌組織的Masson三色染色 (×200)Figure 4 Masson trichrome staining of myocardial tissue in rats in each group (×200)

2.5 HO-1基因修飾的EPC對POH大鼠血液生化指標的影響

各組大鼠血漿ANP及血清LDH、SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見表2)。與假手術(shù)組相比，POH組大鼠的血漿ANP、血清LDH、MDA、IL-17和TGF-β水平升高，SOD和CAT水平降低(P<0.05)。與POH組相比，EPC組、pcDNA3.1-NC-EPC組和pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的血漿ANP、血清LDH、MDA、IL-17和TGF-β水平降低，SOD和CAT水平升高(P<0.05)。與EPC組相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠的血漿ANP、血清LDH、MDA、IL-17和TGF-β水平降低，SOD和CAT水平升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠血漿ANP及血清LDH、SOD、CAT、MDA、IL-17和TGF-β水平Table 2 Plasma ANP and serum LDH, SOD, CAT, MDA, IL-17 and TGF-β in rats in each group

2.6 HO-1基因修飾的EPC對POH大鼠心肌組織中HO-1的mRNA和蛋白表達的影響

各組大鼠心肌組織中HO-1的mRNA和蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(mRNA：F=5 383.310，P<0.001；蛋白：F=385.777，P<0.001)。與假手術(shù)組相比，POH組大鼠中HO-1的mRNA和蛋白表達水平均降低(P<0.05)。與POH組相比，EPC組、pcDNA3.1-NC-EPC組和pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠中HO-1的mRNA和蛋白表達水平均升高(P<0.05)。與EPC組相比，pcDNA3.1-HO-1-EPC組大鼠中HO-1的mRNA和蛋白表達水平均升高(P<0.05，見圖5)。

A.HO-1 mRNA相對表達量 B.Western blotting檢測HO-1蛋白表達量與假手術(shù)組比較，* P <0.05；與POH組比較，#P <0.05；與EPC組比較，&P <0.05圖5 各組大鼠心肌組織中HO-1 mRNA和蛋白表達水平Figure 5 HO-1 mRNA and protein expression levels in myocardial tissues of rats in each group

3 討論

高血壓可誘導(dǎo)心肌肥厚，進而導(dǎo)致心臟功能障礙[10]。嚴重的心肌肥厚可促進受損線粒體和錯誤折疊蛋白的過度累積，從而引起心力衰竭[11,12]。因此，抑制心肌肥厚已成為緩解高血壓相關(guān)心力衰竭的重要治療方向。神經(jīng)體液系統(tǒng)的激活是導(dǎo)致高血壓性心肌肥厚發(fā)生的重要機制之一，雖然多種神經(jīng)體液因子拮抗劑已經(jīng)應(yīng)用于高血壓的治療中，但是仍然無法阻遏心臟向失代償發(fā)展的趨勢，因此急需要探索新的治療策略。血管內(nèi)皮功能不全是高血壓及心肌肥厚的重要病理基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細胞功能障礙表現(xiàn)為擴血管物質(zhì)分泌下降以及縮血管物質(zhì)分泌增加，從而引起血壓升高。內(nèi)皮細胞損傷還可進一步促進炎癥細胞浸潤及間質(zhì)細胞增殖，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。因此，改善內(nèi)皮細胞功能是高血壓以及心肌肥厚防治的重要措施。EPC是一種多能干細胞，EPC可黏附到血管損傷區(qū)并分化為內(nèi)皮細胞，同時誘導(dǎo)成熟內(nèi)皮細胞遷移，促進血管新生和內(nèi)皮更新。已有研究應(yīng)用外周血源性EPC治療心肌缺血再灌注大鼠，發(fā)現(xiàn)EPC降低了心肌梗死面積并提高了內(nèi)皮功能[6]。然而，高血壓狀態(tài)下EPC功能下降將制約EPC移植后的作用。本研究對EPC進行了HO-1基因修飾，結(jié)果表明，HO-1基因修飾的EPC具有更強的遷移能力。由于高血壓可降低EPC黏附、遷移能力[7]，本研究表明HO-1基因修飾的EPC具有更高的黏附和遷移能力，該結(jié)果為本研究的順利開展打下了基礎(chǔ)。

本研究中，與未進行基因修飾的EPC相比，HO-1基因修飾的EPC對POH大鼠血壓及血流動力學(xué)參數(shù)具有更好的改善效果，表現(xiàn)為對SBP水平的降低和對EF和FS水平的升高。并且，HO-1基因修飾的EPC治療的POH大鼠心臟損傷生物標志物(血漿ANP和血清LDH)水平更低。此外，與未進行基因修改的EPC相比，HO-1基因修飾的EPC明顯降低了POH大鼠的心肌細胞直徑和心肌纖維化面積，這些結(jié)果說明，HO-1基因修飾的EPC通過抑制POH大鼠心肌肥厚和纖維化提高了心臟功能并減輕了心臟損傷，并且其心臟保護作用優(yōu)于EPC。

炎癥和氧化應(yīng)激是心肌肥厚和纖維化進展過程中必不可少的兩個因素，兩者相輔相成[13,14]。本研究表明，與未進行基因修飾的EPC治療的POH大鼠相比，HO-1基因修飾的EPC治療的POH大鼠血清膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA及炎癥因子IL-17和TGF-β水平降低，而抗氧化酶SOD和CAT水平升高，說明HO-1基因修飾的EPC提高了POH大鼠的抗氧化能力并抑制了炎癥，其原因可能與HO-1的高抗氧化作用有關(guān)。機體中HO-1的分泌是一種重要的防御機制，可以抵抗各種損傷后組織和細胞的進一步氧化損傷[15]。在心肌肥厚的治療中，許多藥物是通過作用于HO-1基因網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮治療作用。例如，黃芪甲苷對大鼠心肌肥厚的保護作用部分是通過激活Nrf2/HO-1信號通路實現(xiàn)的[16]。還有文獻指出，過表達HO-1可通過NF-kappaB依賴機制(一種炎癥信號通路)抑制ROS誘導(dǎo)的心肌細胞肥大，糾正氧化還原平衡[17]。基于上述結(jié)果可知，對EPC進行HO-1基因修飾可能有助于提高EPC的抗氧化和抗炎功能，這也是其治療心肌肥厚的主要機制。

綜上所述，HO-1基因修飾的EPC具有更強的遷移能力、抗氧化和抗炎功能，從而在治療POH大鼠心肌肥厚中發(fā)揮了更好的治療效果。因此，HO-1基因修飾的EPC可能是治療高血壓相關(guān)心肌肥厚的一種潛在方法。