七氟烷后處理對心肌缺血再灌注大鼠認知及海馬炎癥反應(yīng)的影響

趙雪麗,楊文曲,韓沖芳*,常 鑫,陳 焱

(1 山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院麻醉教研室，太原 030001；2 山西白求恩醫(yī)院麻醉科；*通訊作者,E-mail:hanchongfang2003@foxmail.com)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是心臟手術(shù)常見的病理生理過程，會誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)[1]。海馬是學(xué)習(xí)和記憶等認知功能的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬神經(jīng)元發(fā)生炎癥反應(yīng)、凋亡與POCD的發(fā)生密切相關(guān)[2,3]。七氟烷的器官保護作用一直引起廣泛關(guān)注，動物實驗與臨床研究發(fā)現(xiàn)七氟烷后處理具有心肌保護作用[4,5]，因此臨床上常用七氟烷后處理進行心肌保護。另有研究發(fā)現(xiàn)七氟烷后處理有抗炎和神經(jīng)元保護作用[6,7]，但其是否能改善心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)的認知功能障礙鮮有報道。本研究擬探討七氟烷后處理對心肌缺血再灌注大鼠認知及海馬炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠36只，2～3月齡，體質(zhì)量200～250 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(晉)2015-0001，本實驗嚴格遵守國家動物福利倫理及保護規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

動物呼吸機(上海奧爾特生物科技有限公司)；多功能監(jiān)護儀(成都泰盟科技有限公司)；cTnI ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；七氟烷(上海恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；TUNEL試劑盒(北京碧云天科技有限公司)；IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天科技有限公司)；兔抗鼠GAPDH多克隆抗體、兔抗鼠IL-1β多克隆抗體、兔抗鼠IL-6多克隆抗體、兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體(Proteintech公司)。

1.3 動物分組及模型建立

所有大鼠在通風(fēng)良好的動物室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，維持溫度(23 ±3)℃，相對濕度為40%～70%，并給與充足的水與食物。采用隨機數(shù)字表法將36只大鼠分為3組(n=12)：假手術(shù)組(sham組)、心肌缺血再灌注組(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R組)、七氟烷后處理+心肌缺血再灌注組(SP組)。大鼠實驗前禁食12 h，自由飲水。參照文獻[4]制備心肌缺血再灌注大鼠模型，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉，待大鼠翻正反射消失，將大鼠取仰臥位固定于實驗臺上，用14G套管經(jīng)口進行氣管插管，連接動物呼吸機進行機械通氣，潮氣量2.5 ml/100 g，頻率為60次/min，連接多功能監(jiān)護儀進行心電監(jiān)護，鈍性分離股動脈，置入測壓管監(jiān)測血壓。沿大鼠左側(cè)4～5肋間進胸，暴露心臟，用6-0絲線在左心耳下方(左心耳與肺動脈圓錐間)結(jié)扎左冠脈前降支，收緊結(jié)扎線后心電圖顯示ST-T段抬高，T波高聳且結(jié)扎線遠端心肌組織出現(xiàn)發(fā)紺，標志結(jié)扎成功。缺血30 min后放松結(jié)扎線，抬高的ST-T段降低1/2以上，缺血的心肌逐漸變紅，標志心肌再灌注成功，再灌注120 min后，將大鼠胸部傷口縫合，等大鼠清醒后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。sham組大鼠對左冠脈前降支僅穿線而不進行結(jié)扎；SP組大鼠參照文獻[4]于再灌注前10 min時開始吸入2.4%的七氟烷，持續(xù)15 min。建模完成后在原有分組下對大鼠進行以下的后續(xù)實驗操作。

1.4 ELISA法檢測血清cTnI濃度

再灌注120 min時從大鼠股動脈采血2 ml，靜置5 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心5 min后取上清液，按照使用說明，用ELISA試劑盒檢測血清cTnI濃度。

1.5 Morris水迷宮評價大鼠的認知功能

再灌注后第1～5天采用Morris水迷宮實驗評價大鼠認知功能。①再灌注后第1～4天進行定向航行實驗：每次實驗前先將大鼠放在平臺上適應(yīng)30 s，然后將大鼠從不同象限面向池壁放入水池，以入水起至找到平臺的時間為潛伏期，記錄潛伏期，如果在60 s內(nèi)大鼠未找到平臺，則引導(dǎo)其至平臺上適應(yīng)15 s，潛伏期記為60 s，每天3次，取平均值作為當天測試結(jié)果。②空間探索實驗：再灌注后第5天將平臺撤去，隨機選一象限將大鼠面向池壁放入水池，記錄60 s內(nèi)大鼠在原平臺象限停留時間以及穿越原平臺次數(shù)。

1.6 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡程度

空間探索實驗結(jié)束后，迅速將大鼠斷頭處死，分離出雙側(cè)海馬組織。取出的海馬組織一部分用于ELISA檢測，一部分用于制備腦組織切片，另一部分用于Western blot檢測。將海馬組織用4%的多聚甲醛溶液固定24 h后進行石蠟包埋，制成3 μm厚的切片，將切片脫蠟與水化后，滴加適量蛋白酶K，室溫孵育20 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加3%過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加100 μl通透液，室溫孵育5 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加TUNEL工作液避光孵育30 min，PBS洗滌10 min×3次,滴加50 μl轉(zhuǎn)化劑-POD，避光孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加DAB顯色液，顯色5 min，用蒸餾水沖洗玻片終止反應(yīng)，于高倍鏡下觀察海馬神經(jīng)元細胞的凋亡情況，隨機選擇5個互相不重疊的視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)，并計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%。

1.7 ELISA法測定海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平

參照文獻[8]的方法將海馬組織制備成勻漿，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心15 min后取上清液，嚴格按照使用說明，用ELISA試劑盒檢測海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.8 Western blot檢測大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達量

取海馬組織加適量細胞裂解液，置于冰上反應(yīng)15 min，離心后取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液沸水煮10 min。上樣，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂牛奶室溫下封閉60 min，加一抗(IL-1β、IL-6、TNF-α抗體稀釋度為1 ∶1 000，GAPDH抗體稀釋度為1 ∶20 000)，4 ℃孵育過夜，PBST清洗5 min×3次，加二抗(HRP標記的羊抗兔IgG抗體稀釋度為1 ∶5 000)，室溫孵育60 min，PBST清洗5 min×3次，用發(fā)光液顯色，曝光、顯影、定影，Image J軟件分析灰度值，計算目標蛋白表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清cTnI濃度比較

與sham組相比，MI/R組和SP組大鼠血清cTnI濃度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI/R組相比，SP組大鼠血清cTnI濃度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

與sham組相比，* P <0.05;與MI/R組相比，#P <0.05圖1 各組大鼠血清cTnI濃度的比較Figure 1 Comparison of serum cTnI concentration between groups

2.2 大鼠逃避潛伏期的比較

與sham組相比，MI/R組和SP組大鼠各時間點逃避潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI/R組相比，SP組大鼠各時間點逃避潛伏期都縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

與sham組相比，* P <0.05;與MI/R組相比，#P <0.05圖2 各組大鼠逃避潛伏期的比較Figure 2 Comparison of escape latency of rats between groups

2.3 大鼠原平臺象限停留時間和穿過原平臺次數(shù)比較

與sham組相比，MI/R組和SP組大鼠原平臺象限停留時間縮短，穿過原平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MI/R組相比，SP組大鼠原平臺象限停留時間延長，穿過原平臺次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 各組大鼠原平臺象限停留時間和穿過原平臺次數(shù)的比較Table 1 Comparison of quadrant stay time and times of crossing the original platform between

2.4 大鼠海馬神經(jīng)元凋亡程度比較

sham組大鼠海馬區(qū)僅有個別凋亡細胞，MI/R組大鼠海馬區(qū)可見大量凋亡細胞，SP組大鼠海馬區(qū)有少量凋亡細胞(見圖3)。與sham組相比，MI/R組和SP組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與MI/R組相比，SP組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)下降(P<0.05，見表2)。

圖3 大鼠海馬組織TUNEL染色 (×400)Figure 3 TUNEL staining of the hippocampus in rats (×400)

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)的比較Table 2 Comparison of hippocampal neuron apoptosis index between

2.5 大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

與sham組相比，MI/R組和SP組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.05)；與MI/R組相比，SP組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α含量下降(P<0.05，見圖4)。

與sham組相比，* P <0.05;與MI/R組相比，#P <0.05圖4 各組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的比較Figure 4 Comparison of the contents of IL-1β,IL-6 and TNF-αin hippocampus of rats in each group

2.6 大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達量比較

與sham組相比，MI/R組和SP組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達量升高(P<0.05)；與MI/R組相比，SP組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達量下降(P<0.05，見圖5)。

3 討論

POCD是術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴重影響患者康復(fù)，延長住院時間，加重了醫(yī)療護理和社會經(jīng)濟負擔(dān)，POCD的防治成為當前研究熱點之一[1]。有研究表明七氟烷后處理抗炎和神經(jīng)元保護作用[6,7]，本研究通過建立心肌缺血再灌注模型，探究七氟烷后處理能否改善MIRI誘發(fā)的認知功能障礙，為POCD的防治提供新思路。

結(jié)扎左冠脈前降支是制備心肌缺血再灌注模型的經(jīng)典方法，本研究參照文獻[4]結(jié)扎左冠脈前降支30 min，再灌注120 min制備心肌缺血再灌注大鼠模型。cTnI存在于心肌細胞中，當心肌細胞受損時會穿透細胞膜釋放入血，是判斷心肌損傷的特異性標志物[9]，研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注處理后，大鼠血清cTnI水平升高，證實大鼠出現(xiàn)心肌損傷；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)七氟烷后處理具有心肌保護作用，本研究顯示七氟烷后處理使大鼠血清cTnI水平降低，與前期實驗結(jié)果一致[4]。

Morris水迷宮是一種評估嚙齒類動物認知功能的經(jīng)典測試[10,11]，本研究參照文獻[12]進行定向航行實驗和空間探索實驗評價大鼠的記憶和空間學(xué)習(xí)能力。結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注處理后，大鼠逃避潛伏期延長，原平臺象限停留時間縮短，穿越原平臺次數(shù)減少，表明心肌缺血再灌注損傷會導(dǎo)致大鼠認知功能障礙，與Evonuk等[1]的結(jié)果一致；七氟烷干預(yù)后大鼠逃避潛伏期縮短，原平臺象限停留時間延長，穿越原平臺次數(shù)增多，提示七氟烷后處理可以改善心肌缺血再灌注大鼠的認知功能。

海馬神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶功能中發(fā)揮重要作用，海馬神經(jīng)元凋亡與認知功能障礙的發(fā)病機制直接相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)凋亡細胞增多，提示心肌缺血再灌注損傷引起的認知功能障礙與海馬神經(jīng)元凋亡增加有關(guān)；給予七氟烷后處理大鼠海馬區(qū)凋亡細胞減少，提示七氟烷后處理可以通過抑制海馬神經(jīng)元凋亡改善心肌缺血再灌注大鼠的認知功能。

神經(jīng)炎癥已被確定為POCD發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[14]。缺血的心肌恢復(fù)灌注會引起炎癥反應(yīng)，釋放大量的炎性介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些炎性因子在造成心肌細胞損傷的同時，還可以破壞血腦屏障進入中樞，激活中樞免疫系統(tǒng)，活化膠質(zhì)細胞，釋放炎性因子，誘發(fā)神經(jīng)炎癥[15-17]。IL-1β、IL-6、TNF-α是神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的重要的促炎因子，這些炎癥因子不僅能促進大量的炎性介質(zhì)釋放，還能與神經(jīng)元膜上的受體結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，造成腦組織損傷和認知功能障礙[18-21]。本研究中，心肌缺血再灌注大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及蛋白表達水平升高，提示心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的認知功能與神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān),與Yuan等[17]的觀點一致。七氟烷后處理使大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量及蛋白表達水平下調(diào)，提示七氟烷后處理可以通過抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)改善心肌缺血再灌注大鼠的認知功能。

綜上所述，七氟烷后處理可以改善心肌缺血再灌注大鼠的認知功能，與其抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)。本實驗的不足之處是未能闡明七氟烷后處理抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的具體機制，有待進一步探究。