高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速分析三子散的入血成分及代謝產(chǎn)物

張慧文, 夏慧敏, 劉 宏, 劉妍妍, 久 欣, 張敏惠, 何春龍, 王煥蕓

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

蒙藥復(fù)方制劑三子散,蒙文名為圖喜木勒-3,由訶子、川楝子、梔子3味藥材等比例組成,最早收載于《四部醫(yī)典》,現(xiàn)收載于2020版《中國(guó)藥典》中[1],具有清熱涼血、解毒的功效,蒙醫(yī)用于治療與血、熱、濕有關(guān)的疾病,臨床上常用于治療高血壓、高血脂和動(dòng)脈粥樣硬化等[2],蒙醫(yī)中還采用三子散結(jié)合放血療法用于高脂血癥的治療。三子散臨床用藥主要采用口服給藥方式,而藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程,與藥物發(fā)揮藥理作用和療效的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,考察灌胃給藥后的入血成分有助于闡明三子散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。而目前三子散的研究?jī)H關(guān)注于其主要化學(xué)成分含量的研究,缺少對(duì)三子散的體內(nèi)代謝和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

中藥是一個(gè)多種類多成分綜合作用的復(fù)雜體系,其中的有效成分需要吸收入血,并作用于相應(yīng)靶點(diǎn)才能發(fā)揮整體藥效作用。因此王喜軍發(fā)展并提出了“中藥血清藥物化學(xué)”研究思路[3,4],即采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS),以給藥后的動(dòng)物血清為研究對(duì)象,通過(guò)比對(duì)藥材中的成分、空白血清以及含藥血清進(jìn)行鑒定分析,明確血中移行成分,結(jié)合化合物的質(zhì)譜信息快速、精準(zhǔn)地篩選出藥效成分,為進(jìn)一步闡明復(fù)方制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。HPLC-MS同時(shí)兼?zhèn)淞烁咝б合嗌V的分離手段和質(zhì)譜檢測(cè)功能,具有高靈敏、高分辨、高通量的優(yōu)勢(shì)[5],這使得它在藥物代謝轉(zhuǎn)化的研究過(guò)程中,對(duì)藥物成分和代謝產(chǎn)物的鑒定分析發(fā)揮了重要作用。

本課題組前期建立了三子散HPLC指紋圖譜及一測(cè)多評(píng)分析方法[6-8],并通過(guò)文獻(xiàn)檢索及前期實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)三子散中的化合物包括鞣質(zhì)、酚酸、環(huán)烯醚萜、單萜、三萜、有機(jī)酸酯類成分等,但尚未明確入血成分及其體內(nèi)代謝途徑。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(HPLC-Q/Orbitrap HRMS),對(duì)照已鑒定的三子散復(fù)方中的化學(xué)成分,分析大鼠體內(nèi)三子散入血原型、代謝成分及化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,建立一種快速有效分析三子散入血成分及其代謝途徑的分析方法,為進(jìn)一步闡明三子散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律提供研究依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-Exactive高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo公司); AB 135-S型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士Metter Toledo公司); KQ-250 DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); WH-1微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠); 3K15低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

沒(méi)食子酸(批號(hào):110831-200302,中國(guó)藥品生物制品檢定所);鞣花酸(批號(hào):C10024692,上海麥克林生化科技有限公司);沒(méi)食子酸甲酯(批號(hào):A1810031)、莽草酸(批號(hào):G1509047)、沒(méi)食子酸乙酯(批號(hào):E119029)和奎寧酸(批號(hào):Q109705)均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;甲醇(色譜純,美國(guó)Thermo公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

訶子為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)的干燥成熟果實(shí)(批號(hào):18042801,產(chǎn)地:廣西);梔子為茜草科梔子(GardeniajasminoidesEllis.)的干燥成熟果實(shí)(批號(hào):171001429,產(chǎn)地:江西);川楝子為楝科植物川楝子(MeliatoosendanSieb. et Zucc.)的干燥成熟果實(shí)(批號(hào):170801,產(chǎn)地:四川);性狀均符合2020年版《中國(guó)藥典》(一部)的規(guī)定。

Wistar大鼠,體重范圍200～250 g,購(gòu)買(mǎi)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取對(duì)照品沒(méi)食子酸、鞣花酸、沒(méi)食子酸甲酯、莽草酸、沒(méi)食子酸乙酯、奎寧酸適量,精密稱定,加甲醇制成200 mg/L的對(duì)照品溶液,12 000 r/min離心5 min后取上清,即得。

1.3 給藥樣品的制備

取訶子、梔子、川楝子三味藥材粉碎,過(guò)40目篩,等量混勻,稱取200 g三子散粉末,蒸餾水超聲提取3次,每次1 h,合并提取液,減壓濃縮后,冷凍干燥制成三子散凍干粉。

稱取50 g三子散粉末,加入50 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉,配制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的三子散溶液。

1.4 血清樣品的采集

取12只Wistar大鼠,隨機(jī)分成空白組和給藥組,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,全程不禁水。給藥組給予5 mL三子散溶液,空白組給予5 mL蒸餾水,連續(xù)灌胃3 d,最后一次給藥1 h后,腹主動(dòng)脈取血,3 500 r/min離心10 min后取上清,-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?空白血清收集方式相同。

1.5 血清樣品的處理

分別吸取1 mL空白組血清和三子散給藥血清,加入3 mL甲醇沉淀蛋白質(zhì),渦旋1 min后,12 000 r/min離心取上清,氮吹,加入200 μL甲醇,渦旋1 min復(fù)溶后,12 000 r/min離心后取上清,HPLC-Q/Orbitrap HRMS檢測(cè)。

1.6 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:SHIMADZU GIST C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.5 mL/min;流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B:甲醇。梯度洗脫程序:0～10 min, 1%B～15%B; 10～30 min, 15%B～30%B; 30～45 min, 30%B～35%B; 45～75 min, 35%B～47%B; 75～85 min, 47%B～85%B; 85～95 min, 85%B～90%B。

離子源:加熱電噴霧電離(HESI)源;正離子和負(fù)離子模式同時(shí)掃描;噴霧電壓:4 000 V(ESI+)/3 500 V(ESI-);碰撞能量(CE):45 eV(ESI+)和30 eV(ESI-);輔助氣體體積流量:30 L/min;離子傳輸管溫度:300 ℃;輔助氣溫度:100 ℃;檢測(cè)方式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描(Full-MS/dd-MS2)模式;Full MS分辨率70 000, dd-MS2分辨率17 500;掃描范圍m/z100～1 500。

1.7 三子散體內(nèi)入血成分及代謝產(chǎn)物的鑒定

查閱數(shù)據(jù)庫(kù)、各類成分體內(nèi)代謝途徑、三子散成分的相關(guān)文獻(xiàn),采用Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行峰提取、峰匹配等質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理,結(jié)合Compound Discover 3.0軟件對(duì)化合物代謝途徑的預(yù)測(cè)分析和裂解規(guī)律的推斷,收集整理三子散入血成分及代謝產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

三子散中化學(xué)成分復(fù)雜,結(jié)構(gòu)特征繁雜,差異較大,其中,訶子中的酚酸類成分在負(fù)離子模式下易發(fā)生去質(zhì)子化[9],而單萜和環(huán)烯醚萜類成分在正離子模式下易發(fā)生質(zhì)子化[10],故兼顧不同成分特性選用正、負(fù)離子兩種模式進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)流動(dòng)相中不加甲酸時(shí),以沒(méi)食子酸為代表的酚酸類成分出現(xiàn)峰分離度低及峰形拖尾等現(xiàn)象,加入甲酸后,這種情況消失,因此選用0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。

2.1.2樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

三子散在臨床上是通過(guò)口服給藥,因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體的給藥方式,選擇水作為提取溶劑,并比較回流和超聲兩種提取方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取更完全,由于提取溶劑為水,加熱回流的溫度要求較高,可能將藥材中部分受熱不穩(wěn)定的成分破壞,故選擇超聲提取方式及冷凍干燥方式濃縮。

血清樣品處理中,分別采用甲醇和乙腈進(jìn)行血清蛋白質(zhì)的沉淀,乙腈沉淀后的血樣不能完全和血樣進(jìn)行混合,無(wú)法將蛋白質(zhì)完全沉淀出來(lái),影響化學(xué)成分的鑒定,而甲醇可與血清均勻混合并沉淀完全,因此選擇甲醇沉淀蛋白質(zhì)。

2.2 三子散原型成分鑒定

運(yùn)用HPLC-Q/Orbitrap HRMS技術(shù)對(duì)空白組及給藥組大鼠血清進(jìn)行分析,采用Compound Discover軟件對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行快速識(shí)別及分析鑒定,根據(jù)保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子峰和前期三子散化學(xué)成分鑒定結(jié)果進(jìn)行分析鑒定。給藥后血清和空白血清的圖譜見(jiàn)圖1。三子散給藥血清中鑒別出55種入血成分,其中31種來(lái)自訶子[11,12], 23種來(lái)自梔子[13,14], 1種來(lái)自川楝子[15]。其中含有41種原型成分,包括9種鞣質(zhì)、15種酚酸類、7種環(huán)烯醚萜、1種三萜、4種有機(jī)酚酸和5種單萜類成分,鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 大鼠血清中的原型成分Table 1 Prototype components of Sanzi San in rat blood serum

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2.3 三子散入血相關(guān)代謝產(chǎn)物及代謝途徑

三子散入血的原型成分主要有鞣質(zhì)類、環(huán)烯醚萜類和小分子酚酸成分,這幾類成分在體內(nèi)主要代謝途徑包括I相代謝(還原反應(yīng)、水解反應(yīng))和Ⅱ相代謝(甲基化、磺酸酯化和葡萄糖醛酸化),血清中的代謝物主要來(lái)自于訶子和梔子,共有14種,其中9種來(lái)源于訶子,5種來(lái)源于梔子,結(jié)果見(jiàn)表2,提取離子流圖和質(zhì)譜圖譜見(jiàn)圖2。

表 2 大鼠血清中的三子散代謝產(chǎn)物Table 2 Metabolites of Sanzi San in rat blood serum

圖 2 三子散代謝產(chǎn)物的提取離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms (EIC) and MS spectra of metabolites from Sanzi San

2.3.1鞣質(zhì)類化合物的代謝途徑

在大鼠血清中檢測(cè)鞣質(zhì)類有3種代謝途徑:甲基化、脫甲基+脫羥基和脫羥基。以鞣花酸(ellagic acid)為例簡(jiǎn)析鞣質(zhì)類化合物裂解規(guī)律,見(jiàn)圖3a。在負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描,與空白血清比較,灌胃給藥后的大鼠血清樣品中檢測(cè)到鞣花酸的分子離子峰(m/z300.998 57),代謝物M14(tR=86.62 min)產(chǎn)生m/z329.030 27 [M-H]-分子離子峰,相對(duì)分子質(zhì)量比鞣花酸多28 Da,提示其為鞣花酸的甲基化代謝產(chǎn)物,初步推測(cè)為二甲基鞣花酸(dimethyl ellagic acid);代謝物M2(tR=12.10 min)產(chǎn)生m/z259.010 04 [M-H]-分子離子峰,相對(duì)分子質(zhì)量比鞣花酸少42 Da,推測(cè)其可能發(fā)生了脫甲基和脫羥基代謝過(guò)程,推測(cè)該化合物為尿石素(urolithin D)。

圖 3 (a)鞣花酸和(b)京尼平在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig. 3 Metabolic pathway of (a) ellagic acid and (b) genipin in rats

2.3.2環(huán)烯醚萜類化合物的代謝途徑

在大鼠血清中檢測(cè)環(huán)烯醚萜類有4種代謝途徑:葡萄糖醛酸化、脫β-D-葡萄糖苷、水合化、脫甲基。以京尼平(genipin)為例簡(jiǎn)析環(huán)烯醚萜類化合物的裂解規(guī)律,見(jiàn)圖3b。在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描,檢測(cè)到京尼平的分子離子峰(m/z227.090 93);京尼平苷(geniposide)通過(guò)β-D-葡萄糖苷酶分解成京尼平;代謝物M11(tR=37.49 min)產(chǎn)生m/z403.123 44 [M+H]+分子離子峰,相對(duì)分子質(zhì)量比京尼平多了176 Da,提示該化合物是通過(guò)葡萄醛酸化代謝過(guò)程產(chǎn)生的京尼平葡萄糖醛酸化產(chǎn)物;代謝物M12(tR=70.33 min)產(chǎn)生m/z212.068 16 [M+H]+分子離子峰,相對(duì)分子質(zhì)量比京尼平少15 Da,推測(cè)其為京尼平的脫甲基化產(chǎn)物(genipin demethylation)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立HPLC-Q/Orbitrap HRMS快速分析了三子散的入血成分及代謝產(chǎn)物,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行入血成分分析對(duì)比,在大鼠給藥血清中,指認(rèn)出55種入血成分,其中41種原型成分,14種代謝產(chǎn)物。這些成分是復(fù)方中與藥理作用相關(guān)的化學(xué)成分,有助于闡明三子散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),并為其臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。