環(huán)狀RNA在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠H9c2細(xì)胞焦亡中的作用及其機(jī)制

陳鑫哲 王飛 王凱 王曼

(青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，山東 青島 266021)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2010年以來，心血管系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為中國(guó)居民死亡率最高的疾病，每5例死亡者中就有2例死于心血管系統(tǒng)疾病[1]。心肌梗死作為心血管系統(tǒng)疾病的死亡原因之首，值得引起重視并需要進(jìn)行深入研究。因此，有效的早期診斷和治療對(duì)于提高心肌梗死患者的生存質(zhì)量以及降低死亡率至關(guān)重要[2]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類不含5′端帽和3′端Poly A尾首尾結(jié)合的共價(jià)閉合環(huán)狀非編碼RNA[3]。研究顯示，circRNA廣泛存在于真核生物中，其表達(dá)有組織或細(xì)胞特異性，而且circRNA結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，具有成為生物標(biāo)記物的潛力。近期研究顯示，circRNA與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，自噬相關(guān)circRNA(ACR)通過調(diào)控PlNKl/FAM65B信號(hào)通路，以減輕小鼠心肌缺血再灌注(I/R)損傷[4]；circ_00023通過吸附miR-26b-5p，促進(jìn)小鼠心臟成纖維細(xì)胞的纖維化[5]。因此，circRNA在診斷和治療心血管系統(tǒng)疾病方面具有較大潛力，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍不明確。

2001年COOKSON等[6]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)引起的促炎性細(xì)胞死亡方式，并首次提出了細(xì)胞焦亡(pyroptosis)的概念。細(xì)胞焦亡，又被稱為細(xì)胞炎性壞死，是一種由炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞不斷腫脹膨大直至細(xì)胞破裂，致使細(xì)胞內(nèi)容物釋放，從而觸發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。研究顯示，caspase-1抑制劑VX-765能夠抑制細(xì)胞焦亡通路，減少I/R損傷大鼠模型的心肌梗死面積[7]，表明細(xì)胞焦亡與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。circRNA-NNT通過靶向miR-33a-5p調(diào)節(jié)泛素特異性蛋白酶46(USP46)，促進(jìn)心肌細(xì)胞焦亡和心肌I/R損傷[8]。同時(shí)circRNA可能參與心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制；然而，目前仍缺乏關(guān)于circRNA對(duì)心肌I/R損傷調(diào)控機(jī)制的深入研究?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期的高通量測(cè)序分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在缺氧/復(fù)氧(H/R)處理的H9c2細(xì)胞中mmu_circ_0000723的表達(dá)水平顯著降低。在circBase數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果顯示，mmu_circ_0000723位于17號(hào)染色體上的內(nèi)含子區(qū)域，其序列由環(huán)化點(diǎn)間的所有堿基構(gòu)成，序列全長(zhǎng)1 946個(gè)堿基，是一類內(nèi)含子circRNA。盡管mmu_circ_0000723已被circBase數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄，但是尚未見關(guān)于mmu_circ_0000723的研究報(bào)道，并且mmu_circ_0000723在H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡中的作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過敲低H9c2細(xì)胞中mmu_circ_0000723的表達(dá)水平及檢測(cè)H9c2細(xì)胞焦亡活性，進(jìn)一步探討mmu_circ_0000723在H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞焦亡中的作用及其分子機(jī)制，為心肌I/R損傷的治療提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9c2由本實(shí)驗(yàn)室保存，反轉(zhuǎn)錄試劑盒AG11705、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒AG11701購(gòu)自于湖南艾科瑞生物工程有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒A020-2(南京建成生物科技有限公司)，焦亡素D蛋白C端肽段(GSDMD-C)抗體AF4012(美國(guó)AffinitY公司)，mmu_circ_0000723特異性siRNA(siRNA-mmu_circ_0000723)以及陰性對(duì)照siRNA(NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠H9c2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01雙抗混合液(100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并且生長(zhǎng)良好的情況下傳代，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 研究方法

1.3.1H/R處理的H9c2細(xì)胞焦亡活性檢測(cè)及最佳缺氧時(shí)間的確定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔約5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度約達(dá)80%時(shí)，分別進(jìn)行缺氧0 h(A組)、1 h(B組)、3 h(C組)、6 h(D組)、12 h(E組)、24 h(F組)處理后，再進(jìn)行6 h復(fù)氧。并嚴(yán)格按照LDH試劑盒的操作方法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中LDH活性。采用Western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-C、IL-1β和caspase-1的表達(dá)水平。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取均值。根據(jù)各組H9c2細(xì)胞上清液中LDH活性和焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，確定誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的最佳缺氧時(shí)間，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞缺氧處理。

1.3.2H/R處理的H9c2細(xì)胞中circRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔約5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度約達(dá)80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將置于細(xì)胞培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)12 h的H9c2細(xì)胞作為對(duì)照組，H/R處理的H9c2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。通過Trizol法提取兩組細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，隨后嚴(yán)格按照RT-qPCR方法進(jìn)行操作，以GAPDH作為內(nèi)參照，檢測(cè)circRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。引物名稱及其序列見表1。

1.3.3siRNA-mmu_circ_0000723敲低目標(biāo)基因效果驗(yàn)證 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔約5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度約達(dá)60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)不同的處理方法將細(xì)胞分為G～I(xiàn)組。G組置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)12 h，H組轉(zhuǎn)染NC，I組轉(zhuǎn)染siRNA-mmu_circ_0000723，并于轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。采用Trizol法提取G～I(xiàn)組細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，并嚴(yán)格按照RT-qPCR試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，以GAPDH作為內(nèi)參照，檢測(cè)mmu_circ_0000723的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列

1.3.4敲低mmu_circ_0000723對(duì)H9c2細(xì)胞焦亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔約5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)不同的處理方法將細(xì)胞分為J～M組。J組置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)12 h，K組置于厭氧培養(yǎng)箱進(jìn)行H/R處理；H9c2細(xì)胞密度約達(dá)60%時(shí)，L和M組分別轉(zhuǎn)染對(duì)照NC和siRNA-mmu_circ_0000723，并于轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行H/R處理。嚴(yán)格按照LDH試劑盒進(jìn)行操作，分別檢測(cè)J～M組H9c2細(xì)胞上清液中LDH活性，采用Western blot方法檢測(cè)J～M組H9c2細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

將10 mm×10 mm蓋玻片鋪入24孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔約2×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中的蓋玻片上，按照上述J～M組分組方式進(jìn)行處理。嚴(yán)格按照碘化丙啶(PI)染色法對(duì)J～M組細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)H9c2細(xì)胞死亡情況；采用抗熒光淬滅的封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算PI陽(yáng)性細(xì)胞比率。PI陽(yáng)性細(xì)胞比率(%)=死亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 H/R處理后H9c2細(xì)胞焦亡活性檢測(cè)及最佳缺氧時(shí)間的確定

經(jīng)H/R處理后，A～F組H9c2細(xì)胞上清液中LDH活性及GSDMD-C、IL-1β和caspase-1蛋白表達(dá)水平差異均具有顯著性(F=24.86～2 153.00，P<0.05)；與A組相比，D組細(xì)胞中上述4個(gè)指標(biāo)顯著升高(t=4.14～62.88，P<0.05)。缺氧處理6 h的H9c2細(xì)胞(D組)中caspase-1、GSDMD-C和IL-1β的蛋白表達(dá)水平最高，因此，后續(xù)細(xì)胞缺氧時(shí)間均采用6 h。見圖1及表2。

A～F代表A～F組

表2 A～F組中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平及LDH活性比較

2.2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組H9c2細(xì)胞中circRNA的表達(dá)水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組H9c2細(xì)胞當(dāng)中mmu_circ_0000723的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.01、0.56±0.01。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中mmu_circ_0000723的表達(dá)水平明顯降低(t=9.78，P<0.05)；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中circRNA_010的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.00±0.01、0.92±0.01，兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 siRNA-mmu_circ_0000723敲低目標(biāo)基因效果驗(yàn)證

RT-qPCR結(jié)果顯示，G～I(xiàn)組中mmu_circ_0000723的表達(dá)水平分別為1.00±0.01、0.99±0.02和0.57±0.03，組間比較差異有顯著性(F=348.20，P<0.05)；I組mmu_circ_0000723的相對(duì)表達(dá)水平與G組相比顯著降低(t=22.88，P<0.05)；H組中mmu_circ_0000723的相對(duì)表達(dá)水平與G組相比差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 敲低mmu_circ_0000723對(duì)H9c2細(xì)胞焦亡的影響

J～M組H9c2細(xì)胞上清液中LDH活性、PI陽(yáng)性細(xì)胞比例以及GSDMD-C、IL-1β和caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有顯著性(F=34.39～8 528.00，P<0.05)。與K組相比較，M組細(xì)胞中上述5個(gè)指標(biāo)均明顯升高(t=4.99～54.00，P<0.05)，而L組細(xì)胞中上述5個(gè)指標(biāo)差異均無顯著性(P>0.05)。見圖2、3及表3。

J～M代表J～M組

表3 J～M組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平和LDH活性比較

J～M代表J～M組，PI染色，200倍

3 討 論

心血管疾病是危害人類健康的主要疾病之一，患者死亡率逐年增高[1]。既往研究表明，炎癥參與多種心血管疾病病變過程。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種促炎性的細(xì)胞程序性死亡方式，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有著高度相關(guān)性。焦亡的細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜腫脹失去完整性，但細(xì)胞核卻保持完整，DNA片段化、染色質(zhì)高度凝集、細(xì)胞纖維結(jié)構(gòu)被破壞，并伴有明顯的炎癥反應(yīng)，會(huì)加速細(xì)胞的死亡進(jìn)程[9]。作為促炎性的程序性細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞焦亡參與了心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展整個(gè)過程[10-13]。研究顯示，GSDMD是細(xì)胞焦亡通路中的主要執(zhí)行蛋白[14-16]，GSDMD本身沒有活性，而活化的caspase-1能夠?qū)SDMD切割為N端(GSDMD-N)和C端(GSDMD-C)兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，GSDMD-N通過轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)膜附近，與磷脂結(jié)合并多聚化，在細(xì)胞膜上形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹破裂，最終引發(fā)焦亡[17]。為了闡明細(xì)胞焦亡在心肌I/R損傷中作用機(jī)制，本研究通過H/R處理H9c2細(xì)胞，模擬心肌I/R損傷，分別采用LDH試劑盒以及Western blot方法檢測(cè)H/R誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞上清液中LDH活性以及細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧0、1、3、6、12、24 h，復(fù)氧6 h處理后，收集細(xì)胞裂解液行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，缺氧6 h處理后，H9c2細(xì)胞中caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白的表達(dá)水平最高。隨著缺氧時(shí)間不斷增加，細(xì)胞上清液中LDH活性不斷升高。以上結(jié)果表明，H/R處理能夠促進(jìn)H9c2細(xì)胞中焦亡通路蛋白表達(dá)和LDH釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

研究顯示，circRNA能夠作為分子海綿，有結(jié)合小分子RNA(microRNA)和蛋白的活性，廣泛參與多種細(xì)胞信號(hào)通路[18-20]。已有研究證實(shí)了circRNA在骨骼肌缺血性損傷、糖尿病心肌病、糖尿病腎病和急性胰腺炎等疾病中的作用[21-24]。另外，circRNA與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展也有密切關(guān)系[25]。WANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)circRNAMFACR可以通過與miR-652-3p的相互作用，調(diào)控線粒體蛋白18(MTP18)基因的表達(dá)，介導(dǎo)H/R誘發(fā)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死。然而，circRNA在心肌細(xì)胞焦亡中的作用機(jī)制仍不清楚。因此，尋找心臟中特異表達(dá)且參與調(diào)控心肌細(xì)胞焦亡的circRNA至關(guān)重要。在本實(shí)驗(yàn)的前期研究中，對(duì)H/R處理H9c2細(xì)胞的高通量測(cè)序結(jié)果顯示，mmu_circ_0000723在H/R處理的H9c2細(xì)胞中表達(dá)水平較低。以此為基礎(chǔ)，本研究以mmu_circ_0000723為研究對(duì)象，通過RT-qPCR方法證實(shí)mmu_circ_0000723在H/R處理的H9c2細(xì)胞當(dāng)中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示mmu_circ_0000723可能在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步探討mmu_circ_0000723的生物學(xué)功能，本研究采用siRNA敲低H9c2細(xì)胞中mmu_circ_0000723的表達(dá)并分析其對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照H9c2細(xì)胞相比，H/R處理組PI陽(yáng)性細(xì)胞比例和LDH活性增高，且H/R處理的H9c2細(xì)胞中caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白表達(dá)水平升高。因此，H/R能夠誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞焦亡。與僅進(jìn)行H/R處理的H9c2細(xì)胞相比，敲低mmu_circ_0000723后進(jìn)行H/R處理組的PI陽(yáng)性細(xì)胞比例、LDH活性以及caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白的表達(dá)水平均明顯升高。以上結(jié)果表明，敲低mmu_circ_0000723能夠促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞焦亡。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示，在H/R處理的H9c2細(xì)胞中mmu_circ_0000723的表達(dá)水平明顯降低。敲低mmu_circ_0000723能夠促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的caspase-1、GSDMD-C和IL-1β蛋白表達(dá)，加劇H9c2細(xì)胞焦亡。因此，mmu_circ_0000723作為潛在的治療靶標(biāo)，在心血管疾病診斷和治療方面有巨大的價(jià)值。本研究成果為心血管疾病診斷標(biāo)志物的篩選和治療藥物的研發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。