核糖體合成調(diào)控因子1對人乳腺癌細胞順鉑抗性的影響及作用機制

彭翠修 王潤澤 宋軍瑩 侯琳

(青島大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，山東 青島 266071)

根據(jù)2020年發(fā)布的全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌的發(fā)病人數(shù)首次超過肺癌，成為全球第一大癌癥，占所有新增癌癥患者的12%[1]。順鉑是一種廣譜抗癌藥，用于包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的化學治療[2]。由于鉑類藥物的固有耐藥性和獲得性耐藥性[3]，致其臨床應用受限[4-5]。因此，探討乳腺癌細胞順鉑抗性的分子機制，尋找調(diào)控化療耐藥的關鍵性分子靶點尤為重要。

核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)在核糖體的生物合成過程中主要參與25S rRNA的成熟和60S核糖體大亞基的裝配[6]。近年來的研究顯示，RRS1基因在乳腺癌[7-9]、視網(wǎng)膜母細胞瘤[10]、結(jié)直腸癌[11]和肝細胞癌[12]等多種惡性腫瘤中的表達水平顯著升高，且與癌細胞的增殖和凋亡密切相關[8]。研究表明RRS1與乳腺癌細胞的阿霉素抗性有關[13]。然而，尚未發(fā)現(xiàn)關于RRS1與順鉑抗性的研究報道。磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(P-ERK)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關聯(lián)X(BAX)是調(diào)控細胞凋亡的重要蛋白。本研究采用敲降RRS1基因的方法對細胞順鉑化療敏感性和細胞凋亡率進行分析，通過檢測MCF-7/DDP細胞中ERK、P-ERK、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達水平，探討RRS1基因?qū)θ橄侔┘毎樸K抗性的影響及其作用的分子機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌MCF-7細胞系以及人耐順鉑乳腺癌MCF-7(MCF-7/DDP)細胞系(上海傳秋生物科技有限公司)，Cell counting kit-8(CCK8)試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、順鉑(北京索萊寶科技有限公司)，Trizol Reagent、RT-qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物有限公司)，RRS1基因干擾慢病毒(上海吉凱公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體和兔抗人RRS1、ERK、P-ERK、Bcl-2、BAX單克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

以含體積分數(shù)0.10胎牛血清和0.01青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MCF-7細胞，以含體積分數(shù)0.15胎牛血清、0.01青鏈霉素溶液和濃度為0.15 μg/L順鉑的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MCF-7/DDP細胞，將兩種細胞均置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長至融合度約達80%～90%時進行傳代及后續(xù)操作。

1.3 實驗方法

1.3.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測RRS1 mRNA在MCF-7和MCF-7/DDP細胞中的表達 采用Trizol法提取細胞融合度達80%～90%細胞的總RNA，根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書配制相應的反應體系并進行RT-qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參照，每個樣品設置3個復孔，實驗重復3次，最后采用2-△△CT計算MCF-7以及MCF-7/DDP細胞中RRS1 mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.2Western blot法檢測MCF-7以及MCF-7/DDP細胞中RRS1的表達水平 當乳腺癌MCF-7和MCF-7/DDP細胞融合度達到80%～90%時，收集細胞并采用RIPA裂解法分別提取兩種細胞的總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度以后，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，以體積分數(shù)為0.05的脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別以GAPDH和RRS1蛋白單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次以后，加入相應種屬的二抗溶液，室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。加入ECL發(fā)光液，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以GAPDH條帶結(jié)果作為為內(nèi)參蛋白，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.3.3慢病毒感染技術敲降RRS1基因效率的檢測 取對數(shù)生長期的MCF-7/DDP細胞，接種于6孔板中，每孔接種2×105個細胞，待細胞培養(yǎng)至融合度約30%時，分別感染慢病毒shRNA-Ctrl(對照組)和shRNA-RRS1(RRS1-shRNA組)，72 h后收集細胞并分別提取總RNA以及蛋白質(zhì)，分別采用Western blot和RT-qPCR方法檢測兩組細胞中RRS1蛋白及mRNA表達水平，并計算RRS1-shRNA組細胞RRS1基因的敲降效率。

1.3.4CCK8法檢測順鉑對MCF-7/DDP細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50) 取穩(wěn)定感染的對照組和RRS1-shRNA組細胞，分別在96孔板中每孔接種2 000個細胞，分別加入濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.80、1.50、2.50、3.50、4.50、6.00 mg/L的順鉑。每個濃度設置3個復孔，正常條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK8試劑培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定波長450 nm處各孔的吸光度值，分別計算兩組細胞的IC50值。

1.3.5CCK8法檢測MCF-7/DDP細胞的增殖能力取穩(wěn)定感染的對照組和RRS1-shRNA組細胞，分別在96孔板中每孔接種2 000個細胞，每組設置3個復孔，共鋪5個板。置于細胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，每天任取一板檢測細胞增殖能力，連續(xù)5 d。在培養(yǎng)結(jié)束前2 h，每孔加入10 μL的CCK8試劑培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定波長450 nm處各孔的吸光度值，分別計算兩組細胞的增殖能力。

1.3.6細胞周期實驗檢測細胞周期分布 分別收集穩(wěn)定感染的對照組和RRS1-shRNA組細胞上清液，并將消化后的細胞和沖洗細胞后的PBS合并，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，以預冷的PBS清洗細胞1次。棄上清液，加入1.5 mL預冷的PBS和3.5 mL無水乙醇，混勻后，4 ℃固定過夜。離心棄上清液，沉淀加PBS清洗1次。沉淀物加入200 μL PBS和2 μL濃度為250 mg/L的RNA酶，置于37 ℃孵育30 min。后加入0.5 mL濃度為50 mg/L的PI溶液，室溫避光孵育30 min。混勻后，用300目的尼龍篩網(wǎng)將細胞懸液過濾至空EP管中，立即以流式細胞儀檢測兩組細胞的細胞周期分布。

1.3.7Annexin V-APC/PI雙染法檢測細胞凋亡率分別收集穩(wěn)定感染的對照組和RRS1-shRNA組細胞，計數(shù)以后每組取約5×105個細胞，置于離心機中，以600 r/min離心5 min以后，棄上清液，以預冷的PBS清洗細胞1次。加入500 μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞；再加入2.5 μL的Annexin V-APC染液和2.5 μL的PI染液，混勻后，室溫避光孵育15～20 min。用300目的尼龍篩網(wǎng)將細胞懸液過濾至空EP管中，立即以流式細胞儀檢測兩組細胞的細胞凋亡率。

1.3.8Western blot法檢測細胞中ERK、P-ERK、Bcl-2、BAX蛋白相對表達水平 取穩(wěn)定感染的對照組和RRS1-shRNA組細胞，以RIPA裂解法分別提取兩組細胞總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度后，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，以體積分數(shù)0.05的脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別以GAPDH以及RRS1蛋白單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。使用TBST洗膜3次后，加入相應種屬的二抗溶液，室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。加入ECL發(fā)光液，放入成像系統(tǒng)顯影并拍照。以GAPDH條帶結(jié)果為內(nèi)參蛋白。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 8.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組不同時間的比較采用重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7和MCF-7/DDP細胞中RRS1 mRNA和蛋白表達水平比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，MCF-7細胞和MCF-7/DDP細胞中RRS1 mRNA的相對表達水平分別為1.00±0.01、3.42±0.31，兩者比較差異具有顯著性(t=13.50，P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，MCF-7和MCF-7/DDP細胞中RRS1蛋白的相對表達水平分別為0.64±0.05、0.95±0.04，兩者比較差異有顯著性(t=8.29，P<0.05)。見圖1。

圖1 MCF-7和MCF-7/DDP細胞中RRS1蛋白表達水平

2.2 慢病毒感染MCF-7/DDP細胞的RRS1基因敲降效率

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，對照組以及RRS1-shRNA組細胞中RRS1 mRNA的表達水平分別為1.00±0.01和0.15±0.01，兩組比較差異有顯著性(t=86.83，P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組和RRS1-shRNA組細胞中RRS1蛋白的相對表達水平分別為1.04±0.16、0.31±0.10，兩組比較差異有顯著性(t=6.55，P<0.05)。慢病毒感染MCF-7/DDP細胞的RRS1基因敲降效率約為70%以上，可以進行后續(xù)實驗。

2.3 兩組MCF-7/DDP細胞對順鉑敏感性比較

對照組和RRS1-shRNA組細胞的IC50分別為(3.39±0.26)、(1.62±0.27)mg/L，兩組比較差異有顯著性(t=8.22，P<0.05)。

2.4 兩組MCF-7/DDP細胞增殖能力比較

重復測量設計的方差分析結(jié)果顯示，時間、組別和時間組別交互作用對細胞增殖能力均有顯著影響(F時間=2 164.95，F(xiàn)組別=41.00，F(xiàn)交互=12.30，P<0.05)。單獨效應分析結(jié)果顯示，與第1天相比，對照組和RRS1-shRNA組細胞增殖能力均明顯增強(F=1 241.34、935.90，P<0.05)；但是RRS1-shRNA組細胞第4天和第5天的增殖能力均明顯低于對照組細胞(F=17.33、70.35，P<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞的增殖能力比較

2.5 兩組MCF-7/DDP細胞細胞周期分布比較

對照組和RRS1-shRNA組G1期細胞構(gòu)成比分別為(33.81±2.63)%、(54.4±4.68)%，S期細胞構(gòu)成比分別為(37.51±2.70)%、(18.61±2.54)%，G2期的細胞構(gòu)成比分別為(28.71±2.34)%、(27.55±6.88)%，其中，兩組細胞的G1期和S期細胞構(gòu)成比比較，差異均具有顯著性(t=6.64、8.83，P<0.05)。而兩組間G2期細胞構(gòu)成比比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 兩組MCF-7/DDP細胞凋亡率比較

對照組和RRS1-shRNA組細胞的細胞凋亡率分別為(8.93±0.32)%、(22.50±6.77)%，兩組比較差異有顯著性(t=3.47，P<0.05)。細胞凋亡率的變化見圖2。

圖2 兩組細胞的凋亡率比較

2.7 兩組細胞中ERK、p-ERK、Bcl-2、BAX蛋白相對表達水平比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組和RRS1-shRNA組細胞中ERK蛋白相對表達水平比較差異無顯著(P>0.05)，P-ERK、Bcl-2、BAX蛋白相對表達水平比較差異均有顯著性(t=3.06～4.92，P<0.05)。見表3。

表3 兩組細胞中ERK、P-ERK、Bcl-2、BAX蛋白相對表達水平比較

3 討 論

2020年，中國女性新發(fā)癌癥209萬例，其中新發(fā)乳腺癌約42萬例，發(fā)病率位居所有癌癥中的第一位[1]。目前乳腺癌常規(guī)的治療方法是手術切除局部病灶和化療消除全身擴散。作為乳腺癌標準治療的重要組成部分，化療可以明顯改善乳腺癌患者的預后[14]。鉑類化療藥物主要用于治療乳腺癌晚期的患者[2]。然而，鉑類藥物的固有耐藥性及獲得耐藥性，易引發(fā)腫瘤細胞生存活力增加和轉(zhuǎn)移潛能增強，導致患者預后不良[15-16]。因此探究乳腺癌細胞對順鉑產(chǎn)生抗性的機制，尋找調(diào)控乳腺癌順鉑耐藥的關鍵性分子靶點，對乳腺癌綜合治療和提高順鉑療效都有重要意義。

核糖體大小亞基中，與rRNA合成相關的蛋白質(zhì)有70多種，RRS1是其中之一，其參與25S rRNA的成熟和60S核糖體大亞基的裝配過程[6]。越來越多的證據(jù)表明，除了參與核糖體的裝配過程外，核糖體蛋白還參與細胞周期阻滯、免疫信號轉(zhuǎn)導和癌癥發(fā)展等[16-19]。此外，在腫瘤的多藥耐藥中也有重要作用[20-21]，如對人類頭頸癌細胞UMSCC10b與其順鉑耐藥細胞UMSCC10b/Pt-S15的差異表達基因圖譜進行分析顯示，核糖體蛋白S28(RPS28)和延伸因子1α(EF1α)是與順鉑獲得性耐藥相關的2個上調(diào)基因[22]。本課題組前期從數(shù)據(jù)庫中篩選出了與細胞增殖、遷移和侵襲等生物特性相關的基因RRS1，并首次報道了RRS1基因可能通過RPL11/MDM2通路激活p53，進而促進乳腺癌細胞的增殖[7-8]。此外，RRS1基因在肝癌、結(jié)直腸癌和甲狀腺癌細胞中均呈現(xiàn)異常高表達[10-11,23]，干擾RRS1基因表達后，可明顯促進細胞凋亡。凋亡抵抗則是各種癌細胞產(chǎn)生化療藥物抗性的原因之一[24-25]，因此我們推測RRS1基因或許與癌細胞的化療耐藥有關。我們課題組前期的實驗結(jié)果驗證了RRS1基因與乳腺癌細胞的阿霉素抗性相關[12]，但是目前并沒有RRS1基因與乳腺癌細胞順鉑抗性的任何報道，也沒有RRS1基因在乳腺癌細胞順鉑抗性產(chǎn)生過程中作用機制的相關研究。

本研究首次比較人乳腺癌MCF-7細胞和人耐順鉑乳腺癌MCF-7/DDP細胞的RRS1 mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果顯示與MCF-7細胞相比，MCF-7/DDP細胞中RRS1 mRNA和蛋白的相對表達水平均明顯增加，說明RRS1基因在MCF-7/DDP細胞中的高表達與乳腺癌細胞順鉑抗性的產(chǎn)生有關。為進一步探究RRS1基因參與細胞順鉑耐藥的分子機制，本研究通過構(gòu)建慢病毒RRS1-shRNA沉默MCF-7/DDP細胞中RRS1基因的表達，檢測順鉑在敲降RRS1基因前后的兩組細胞中IC50值的變化，其結(jié)果顯示，在沉默RRS1基因后，可使順鉑在MCF-7/DDP細胞的IC50值明顯降低，提示RRS1基因表達水平的升高與順鉑抗性產(chǎn)生相關。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，沉默RRS1基因后，細胞凋亡率明顯增加；分布在G1期的細胞數(shù)目明顯增加，分布在S期的細胞數(shù)目明顯減少，而分布在G2期的細胞數(shù)目無明顯變化，提示敲降RRS1基因后，將細胞主要阻滯在G1期。Western blot檢測結(jié)果顯示，沉默RRS1基因后，P-ERK和凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白的相對表達水平明顯下降，促凋亡蛋白BAX的相對表達水平明顯升高。表明RRS1基因很可能通過激活ERK相關信號通路促進癌細胞增殖，引起細胞的凋亡抵抗進而參與乳腺癌細胞的順鉑抗性。然而，此研究只是在細胞水平上驗證了RRS1基因與乳腺癌細胞MCF-7/DDP順鉑抗性的相關作用，RRS1基因在其他類型乳腺癌細胞藥物抗性的作用和體內(nèi)驗證試驗仍值得我們進一步探索。

綜上所述，本研究首次證實了RRS1基因與乳腺癌細胞的順鉑抗性有關，且其可能是通過激活ERK-BAX-Bcl-2信號通路來發(fā)揮作用，對臨床上提高順鉑療效具有重要意義。