泛素連接酶三基序蛋白21對結直腸癌鞘氨醇激酶2的調控作用及其機制

肖明超 孟昭源 趙姣姣 方文碩 藺吉春 馬蕾娜

(1 青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266071; 2 青島大學附屬醫(yī)院腫瘤研究所)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康[1]。CRC的重要特征之一是細胞中鞘脂代謝的失調[2]。已有研究表明鞘氨醇激酶2(SphK2)在CRC細胞中異常高表達將打破鞘脂代謝平衡，促進CRC細胞的增殖、遷移以及化學治療耐藥的發(fā)生[3-4]。因此，探討SphK2在CRC中的調控以及修飾機制或能為CRC的治療提供更好的策略。盡管SphK2在CRC細胞中的重要功能已被證實，但CRC中SphK2高表達的原因及其上游的調控蛋白尚未完全闡明。泛素化修飾作為重要的翻譯后修飾方式之一，通過調控底物蛋白的穩(wěn)定性、活性或細胞定位而參與調節(jié)重要的細胞過程，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關[5-8]。然而，在CRC中SphK2的泛素化修飾機制并不清楚。三基序蛋白21(TRIM21)是細胞中的一種泛素連接酶，在泛素化修飾過程中起關鍵的催化作用，能直接決定泛素化修飾的特異性及底物蛋白命運，可能是結直腸癌治療的潛在靶點。因此，本研究旨在探討CRC中泛素連接酶TRIM21對SphK2的調控作用及其機制，為CRC的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑

HEK-293T細胞系、PLC/RPF/5細胞系、RKO細胞系均來源于中國科學院上海細胞庫。CCK-8試劑盒(大連美侖生物技術公司)，體外泛素化檢測試劑盒(優(yōu)碧生物公司)，SphK2抗體(武漢Proteintech公司)，Ubquitin抗體、β-Actin抗體(美國CST公司)，TRIM21抗體(武漢愛博泰克公司)，Vinculin抗體、瓊脂糖珠(美國Sigma公司)，谷胱甘肽瓊脂糖珠(美國GE Healthcare公司)，HA-TRIM21質粒、Flag-SK2質粒、His-TRIM21質粒(本課題組實驗室前期構建)、GST-SphK2質粒，psPAX2質粒、PMD2.G質粒、sgTRIM21質粒均購自于Addgene: Homepage網站。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)以及處理 將HEK-293T細胞、PLC/RPF/5細胞、RKO細胞均接種于含體積分數0.10的FBS、體積分數0.01的青霉素-鏈霉素混合液的細胞培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞處于對數生長期時，使用胰酶消化傳代或參照聚乙烯亞胺說明書對細胞進行轉染。

1.2.2采用質譜與免疫共沉淀方法鑒定SphK2與TRIM21的相互作用情況 將轉染Flag-SphK2后的PLC/RPF/5細胞分為a、b、c、d、e組，分別采用表皮生長因子刺激、葡萄糖饑餓處理、過氧化氫刺激、缺氧處理、轉化生長因子-β刺激。轉染48 h后，將細胞裂解并行SDS-PAGE電泳，切取SphK2所在的蛋白凝膠作為質譜樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司進行質譜分析。另外將處于對數生長期的HEK-293T細胞分為f、g組，分別轉染Flag-SphK2、Flag-SphK2+HA-TRIM21質粒。當轉染36 h后，加入10 μmol/L MG132處理細胞12 h。制備細胞裂解液，向裂解液中分別加入HA、Flag抗體偶聯的瓊脂糖珠，參照文獻報道的方法[9]進行免疫共沉淀實驗檢測TRIM21與SphK2的相互作用情況。

1.2.3采用體內泛素化實驗鑒定TRIM21介導的SphK2泛素化 將處于對數生長期HEK-293T細胞分為h、i、j、k組，分別轉染Flag-SphK2、Flag-SphK2+His-Ubquitin、Flag-SphK2+His-Ubquitin+1 μg HA-TRIM21質粒以及Flag-SphK2+His-Ubquitin+4 μg HA-TRIM21質粒。轉染36 h后，加入10 μmol/L MG132處理12 h，參照文獻報道的方法[10]進行His-Ubquitin pull-down實驗檢測SphK2的泛素化水平。

1.2.4采用蛋白質體外結合實驗來鑒定SphK2與TRIM21的相互作用情況 將His-TRIM21、GST-SphK2質粒轉化BL21感受態(tài)大腸桿菌，參照蛋白質純化手冊制備純化的His-TRIM21、GST-SphK2蛋白。之后將兩蛋白混合，將混合液分為p、q組，分別加入瓊脂糖珠以及谷胱甘肽瓊脂糖珠，參照相關文獻報道的方法[11]來進行蛋白體外結合實驗檢測TRIM21與SphK2蛋白相互作用的情況。

1.2.5采用體外泛素化實驗鑒定TRIM21介導的SphK2泛素化 將EP管分為r、s、t三組，每組分別加入GST-SphK2+E1/E2/Ub、GST-SphK2+His-TRIM21、GST-SphK2+His-TRIM21+E1/E2/Ub蛋白。參照體外泛素化試劑盒說明書制備免疫印跡(Western-blot)樣品，檢測TRIM21對SphK2泛素化水平的影響。

1.2.6TRIM21敲除對RKO細胞中SphK2蛋白水平以及蛋白半衰期的影響 參照文獻中報道的方法[12]生產并收集慢病毒。將處于對數生長期的RKO細胞分為u、v、w、x四組，分別感染慢病毒LV-sgTRIM21-1、LV-sgTRIM21-2、LV-sgTRIM21-3以及LV-sgControl，以獲得TRIM21敲除的RKO細胞系。通過Western-blot實驗檢測u～x組細胞中SphK2蛋白水平的變化。之后向u～x組的細胞中分別加入終濃度為20 mg/L的放線菌酮CHX，在加藥后的0、12、24 h收集細胞并對其進行Western-blot實驗，以用于檢測TRIM21敲除對細胞中SphK2半衰期的影響。

1.2.7TRIM21過表達對HEK-293T細胞SphK2蛋白水平的影響 將處于對數生長期的HEK-293T細胞分為l、m、n、o組，分別轉染HA-TRIM21質粒0、0.3、0.6、0.9 μg，進行Western-blot實驗檢測TRIM21外源過表達對SphK2蛋白水平的影響。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值計算，結果取3次重復實驗的均值。

1.2.8TRIM21對RKO細胞5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影響將處于對數生長期的u～x組RKO細胞消化接種于96孔板中，設置7個濃度梯度組，待細胞貼壁后每孔中加入含不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L)5-FU的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48、72、96 h后，向各孔中分別加入10 μL的CCK-8檢測液，并在37 ℃下孵育2 h，最后用酶標儀檢測波長450 nm處各孔的吸光度值，并計算細胞存活率。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 SphK2與TRIM21蛋白相互作用情況

圖1A、B分別為質譜樣品的考馬斯亮藍染色、Western-blot實驗檢測結果，其結果顯示TRIM21、HECTD2、RBBP6、BRE1B、LNX1、HuWE1、DTX3、RNF113A在內的8種泛素連接酶和2種去泛素酶USP15、OTU1均可能與SphK2存在著相互作用。其中，除TRIM21檢測到的肽段數值為17以外，其他7種泛素連接酶的肽段數值均為1，該值越高代表蛋白質的可信度越高。因此進行蛋白質免疫共沉淀、蛋白質體外結合實驗證實TRIM21與SphK2間存在相互作用。其中，蛋白質免疫共沉淀實驗的結果如圖1C、D所示，與f組相比，g組能夠檢測到對應的SphK2及TRIM21條帶，證明SphK2與TRIM21之間可以發(fā)生相互作用。蛋白質體外結合實驗結果如圖1E所示，與p組相比較，q組能檢測到對應的TRIM21條帶，也進一步證實TRIM21與SphK2存在相互作用。

A和B：質譜鑒定SphK2與TRIM21的相互作用情況，C和D：驗證SphK2與TRIM21蛋白在體內的相互作用情況，E:驗證GST-SphK2與His-TRIM21蛋白在體外的相互作用情況

2.2 TRIM21對SphK2泛素化水平的調控作用

體內泛素化實驗結果如圖2A所示，與h、i組相比，j、k組HEK-293T細胞中SphK2泛素化水平隨TRIM21轉染量的增加而提高，證明TRIM21可以介導SphK2發(fā)生泛素化。體外泛素化實驗結果如圖2B所示，與r、s組相比，t組檢測到了SphK2泛素化條帶，進一步證實TRIM21能夠介導SphK2的泛素化修飾。

2.3 TRIM21對SphK2蛋白表達水平的影響

TRIM21外源過表達實驗結果如圖3A所示，l～o組細胞中SphK2蛋白的相對表達量分別為0.23±0.02、0.84±0.08、1.56±0.12、1.72±0.10，與l組比較，m～o組SphK2蛋白相對表達量明顯增高(F=196.22，P<0.05)?；蚯贸龑嶒灲Y果如圖3B所示，x、u、v組細胞中SphK2蛋白相對表達量分別為1.44±0.14、0.37±0.18、0.45±0.19，與x組比較，u、v組細胞中SphK2蛋白的相對表達水平明顯降低(F=37.30，P<0.05)。半衰期實驗結果如圖3C所示，u組SphK2蛋白降解速率高于x組。

A、B分別為體內、體外泛素化實驗驗證TRIM21對SphK2泛素化水平的調控作用

A為HEK-293T細胞過表達TRIM21對SphK2蛋白表達水平的影響，B、C分別為RKO細胞中敲除TRIM21對SphK2蛋白表達水平、蛋白半衰期的影響

2.4 5-Fu不同作用時間對敲除TRIM21的RKO細胞存活率的影響

重復測量設計方差分析結果顯示，時間、組別、時間與組別交互作用對細胞存活率均有明顯的影響(F組別=365.67，F時間=251.95，F時間*組別=16.73，P<0.05)。單獨效應分析結果顯示，在5-Fu處理細胞48、72、96 h后，與x組相比，u～w組細胞的存活率明顯降低(F=24.83～890.51，P<0.05)；并且隨著5-Fu作用時間的增長，u～x四組細胞的存活率顯著降低(F=30.42～92.13，P<0.05)。見表1。

表1 5-Fu不同作用時間對敲除TRIM21的RKO細胞存活率的影響

3 討 論

在世界范圍內，CRC患者的發(fā)病率和死亡率均居前列[13]。據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構公布，我國2020年CRC新發(fā)病例56萬，排名超過胃癌躍居第2位[14]。且隨著生活水平的提高和人口老齡化的加劇，CRC的發(fā)病率還將不斷提高。CRC患者迫切需要高效的治療方案。盡管手術、放化療是長期以來結直腸癌治療的常用策略，但療效并不理想，有待進一步完善。

隨著脂質代謝組學研究的不斷深入，人們認識到CRC的特征之一是鞘脂代謝的失調[2,15]。鞘脂代謝的產物主要包括神經酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sph)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，它們均可以作為信號分子參與級聯反應進而調控細胞內的多種關鍵過程。其中，Cer和Sph可以抑制細胞增殖、促進細胞凋亡,然而與之相反的是S1P可以促進細胞存活以及增殖[16-18]。正常情況下，這3種信號分子在細胞內處于復雜的動態(tài)平衡中：Cer可以被水解生成Sph，而Sph則可以通過鞘氨醇激酶SphK磷酸化生成S1P[19-21]。它們之間的轉化決定著細胞的命運是走向凋亡還是走向增殖。Sphk是這個過程最關鍵的調控酶之一，它包含兩種亞型：SphK1和SphK2。雖然兩種酶高度同源且催化相同的反應，但是它們在亞細胞定位、組織分布等方面并不相同。其中，SphK2在結直腸癌中起到重要的作用，具體表現為：一方面，SphK2在CRC中表現為異常的高表達，這種高表達促進了CRC細胞的增殖、遷移[3]；另一方面，SphK2的高表達可以降低多種CRC化療藥物的抗癌作用[22]，包括全反式維甲酸(ATRA)、丁酸鈉(SB)及一線化療藥物5-Fu，而下調SphK2的表達水平可以增強CRC細胞對這些化療藥物的敏感性[4,19-20]，提示SphK2可能是CRC治療的靶點。盡管結直腸癌中SphK2的重要功能已被證實，但結直腸癌中SphK2高表達的原因及其上游的調控蛋白尚未完全闡明。

本研究首先通過質譜分析、免疫共沉淀及蛋白質體外結合實驗確認了泛素連接酶TRIM21與SphK2蛋白間的相互作用。為探究這種相互作用的具體機制，本研究進行了體內及體外泛素化實驗，證實TRIM21可以介導SphK2的泛素化修飾。隨后，為探索TRIM21介導的SphK2泛素化修飾對SphK2蛋白水平的影響，本研究構建了TRIM21敲除的RKO細胞系，通過Western-blot和半衰期實驗，證明了TRIM21介導的SphK2泛素化修飾能夠穩(wěn)定SphK2蛋白水平?？紤]到有文獻報道SphK2的高表達能提高結直腸癌細胞對5-Fu的耐藥性，所以我們推測，敲除TRIM21或許能夠逆轉結直腸癌細胞對5-Fu的耐藥。本研究通過CCK-8實驗對這一猜想進行了驗證，發(fā)現在5-Fu處理的情況下，TRIM21敲除的RKO細胞存活率顯著低于x組細胞，即TRIM21的敲除提高了RKO細胞對5-Fu的敏感性。

本研究不僅是對SphK2修飾機制在理論上的完善，還對于臨床治療具有參考意義：①提示抑制TRIM21或許能夠作為CRC治療的新策略。由于SphK2對一些腫瘤具有致癌的效應[23-26]，目前已有SphK2抑制劑相關的研究，然而SphK2抑制劑效價低、特異性低，限制了其在臨床治療的應用[22,27]。而本研究發(fā)現TRIM21能穩(wěn)定SphK2蛋白水平，提示可以去開發(fā)TRIM21的抑制劑用于CRC單獨治療，或聯合SphK2抑制劑進行CRC的治療。②提示可以通過抑制TRIM21解決由SphK2高表達導致的5-Fu、ATRA、SB的耐藥問題。耐藥的產生是化療的主要障礙之一，通過抑制TRIM21解決這些藥物的耐藥是一種全新的策略。③提示在CRC中TRIM21可能是預測患者預后的一項指標。

綜上所述，本研究證實了CRC中TRIM21通過與SphK2發(fā)生相互作用，催化SphK2發(fā)生泛素化，這種泛素化穩(wěn)定了SphK2蛋白性能。而敲除TRIM21的CRC細胞的SphK2蛋白水平顯著下降，并且對5-FU敏感性也增加。本研究揭示了TRIM21在CRC細胞中對SphK2的調控作用，并提出了一種解決CRC細胞5-FU耐藥的潛在方案，為CRC治療策略的完善提供了新的支持。