茶皂素對蛞蝓體內(nèi)酶活性的影響

付 莉

(貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005)

0 引言

【研究意義】蛞蝓(AgriolimaxagrestisLinnaeus)屬軟體動物門腹足綱柄眼目蛞蝓科，俗稱鼻涕蟲，其分布廣泛，發(fā)生較普遍，可危害多種農(nóng)作物[1]。目前，蛞蝓的防治主要以噴灑四聚乙醛等化學(xué)農(nóng)藥為主，長期使用極易使蛞蝓產(chǎn)生抗藥性，影響防治效果。茶皂素(Tea saponin)又稱茶皂苷或茶皂甙，是從山茶科植物種子或種子經(jīng)榨油后的產(chǎn)物中提取的一種糖甙化合物，屬于五環(huán)三萜類，廣泛存在于各種茶類植物中[2]。茶皂素不僅具有溶血、魚毒、消炎和類似植物激素等活性，而且是一種優(yōu)良的農(nóng)藥制備助劑，可直接作為生物農(nóng)藥用于防治有害生物[3-4]。弄清茶皂素對蛞蝓體內(nèi)酶活性的影響，對蛞蝓的生物防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】潘如軍等[5]研究表明，茶皂素對甘薯小象甲(Cylasformicarius)有明顯的取食忌避作用和強(qiáng)烈的拒食作用，且茶皂素能使甘薯小象甲幼體發(fā)育歷期縮短，甚至能導(dǎo)致幼體死亡。曾馳等[6]研究表明，30%茶皂素水劑對茶小綠葉蟬(Empoascapirisuga)具有良好的防治效果。王小藝等[7]研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素對菜青蟲(PierisrapaeL.)3～5齡幼蟲均有強(qiáng)烈的拒食作用。王志高等[8]研究表明，40 mg/L和 50 mg/L茶皂素處理48 h對室內(nèi)福壽螺的防治效果達(dá)100%。【研究切入點(diǎn)】茶皂素作為一種良好的植物源農(nóng)藥對多種害蟲防效顯著，還可作為殺螺和殺魚的清塘劑，但未見茶皂素對蛞蝓體內(nèi)酶活性影響的研究報道?！緮M解決關(guān)鍵問題】探明茶皂素對蛞蝓保護(hù)酶和解毒酶活性的影響，以期為蛞蝓的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 蛞蝓600頭，2021年5月中旬采自貴州省長順縣白菜地，帶回實(shí)驗(yàn)室用遮光培養(yǎng)箱飼養(yǎng)，每天飼喂新鮮小白菜，挑選大小一致的蛞蝓進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按文獻(xiàn)[9]的方法鑒定，其為雙線嗜黏液蛞蝓(Phiolomycusbilineatus)，伸展時體長35～37 mm，體寬6～7 mm，體灰白色，腹足底部肉白色，體背部中央和兩側(cè)各有1條黑褐色縱線，生殖孔位于右后觸覺的后側(cè)方。

1.1.2 藥劑與試劑盒 83%茶皂素可濕性粉劑，購自杭州中野天然植物科技有限公司；超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 OCE-Y30型組織研磨器，天根生化科技有限公司；TU-1901型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MX-F型漩渦振蕩器，南京東邁科技儀器有限公司；Thermo-17R型高速冷凍離心機(jī)，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；W202B型恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定 試驗(yàn)于2021年5月在貴州省林業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。茶皂素設(shè)5個濃度處理，以等量清水為對照(CK)，共計6個處理。5個濃度茶皂素處理分別為20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL和1.25 mg/mL。采用浸液法將蛞蝓放入CK和各濃度處理的藥液中浸3 s，取出后直接放入培養(yǎng)皿中，每皿中接入大小一致的蛞蝓10頭，每天放入新鮮白菜葉，3次重復(fù)，將放入蛞蝓的培養(yǎng)皿進(jìn)行遮光處理，統(tǒng)計72 h蛞蝓死亡數(shù)，采用SPSS 26.0得出毒力方程。

1.2.2 試蟲處理 根據(jù)毒力測定結(jié)果，以72 h的LC20作為亞致死濃度，處理健康、大小一致的蛞蝓，處理時間設(shè)6 h(處理1)、12 h(處理2)、24 h(處理3)、48 h(處理4)和72 h(處理5)5個處理, 均以等量清水相同處理時間為對照(CK)。處理完成后取健壯、活潑的幼蟲，冰箱中-80℃保存，用于酶活性測定。

1.2.3 酶活性測定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、乙酰膽堿酯酶(AchE)酶液的制備及活性測定方法參照各試劑盒說明，采用分光光度法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，處理間差異采用單因素方差分析，用LSD方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對蛞蝓的毒力

試驗(yàn)結(jié)果表明，茶皂素對蛞蝓的毒力方程為y=2.949x-2.934，R為0.975；亞致死濃度(LC20)為5.123 mg/mL，95%置信區(qū)間為2.722～7.355；致死中濃度(LC50)為9.883 mg/mL，95%置信區(qū)間為6.805～14.480，說明茶皂素對蛞蝓具有較高的浸殺活性。

2.2 茶皂素不同時間處理蛞蝓保護(hù)酶的活性

從表1看出，茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓幼蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等保護(hù)酶活性具有激活和抑制作用。SOD：不同時間處理及同期CK分別為1.31～2.43 U/mg和2.97～3.35 U/mg，不同時間處理酶活性均低于CK，各處理較CK降低18.46%～56.04%，除處理4與CK間差異顯著外，其余時間處理與CK間差異極顯著，表明不同時間處理對SOD活性均具有抑制作用。POD：不同時間處理及同期CK分別為3.87～4.58 U/mg和3.82～5.36 U/mg，除處理1與CK間差異極顯著外，其余時間處理與CK間差異均不顯著；其中，處理2和處理4較CK分別升高1.33%和8.12%，處理1、處理3和處理5較CK分別降低27.80%、4.09%和13.79%，表明處理2和處理4對POD活性具有激活作用，處理1、處理3和處理5對POD活性具有抑制作用。CAT：不同時間處理及同期CK分別為15.99～28.33 U/mg和20.28～27.28 U/mg，各處理與CK間均差異極顯著，處理1和處理2較CK分別升高29.66%和9.80%；處理3、處理4和處理5較CK分別降低12.18%、41.39%和30.70%，表明處理1和處理2對CAT活性具有激活作用，處理3～5對CAT活性具有抑制作用。

表1 茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓保護(hù)酶的活性

2.3 茶皂素不同時間處理蛞蝓解毒酶的活性

從表2可知，茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)等解毒酶活性均具有抑制作用。CarE：不同時間處理及同期CK分別為4.57～5.97 U/mg和5.45～6.16 U/mg，各處理較CK降低3.08%～23.06%，除處理2和處理4與CK間差異極顯著外，其余處理與CK間差異均不顯著。AchE：不同時間處理及同期CK分別為0.44～0.58 U/mg和0.59～0.65 U/mg，各處理較CK降低6.45%～31.25%，各處理與CK間差異極顯著。GSTs：不同時間處理及同期CK分別為39.00～56.74 U/mg和51.06～65.61 U/mg，各處理較CK降低13.52%～29.43%，各處理與CK間差異極顯著。

表2 茶皂素亞致死濃度(LC20)不同時間處理蛞蝓解毒酶的活性

3 討論

超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶統(tǒng)稱為保護(hù)酶系統(tǒng)[10]，在3種酶的共同作用下，細(xì)胞內(nèi)的自由基維持在一個較低水平，從而防止自由基毒害。吳德東等[11]報道，舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲經(jīng)北烏頭乙酸乙酯萃取物亞致死濃度(LC20)處理后，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性均為先激活后抑制。何發(fā)林等[12]研究表明，溴氰蟲酰胺亞致死劑量初期可誘導(dǎo)小地老虎(Agrotisipsilon)體內(nèi)過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性升高。研究結(jié)果表明，茶皂素亞致死濃度(LC20)對蛞蝓體內(nèi)SOD活性表現(xiàn)為抑制作用，對POD活性表現(xiàn)為抑制-激活-抑制-激活-抑制作用，對CAT活性表現(xiàn)為先激活后抑制作用。

羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在分解外源毒物、維持正常生理代謝方面起著重要作用[13]。張振威等[14]研究發(fā)現(xiàn)，舞毒蛾2齡幼蟲體內(nèi)AchE活性在甲維鹽的作用下均明顯受到抑制，處理 24 h 后GSTs 活性被激活。白桂芬等[15]研究表明，多菌靈對蚯蚓(Earthworm)體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶整體具有抑制作用，對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶整體具有激活作用，對羧酸酯酶活性在低濃度時具有誘導(dǎo)激活作用，高濃度時具有抑制作用。張文領(lǐng)等[16]報道，福壽螺螺(Pomaceacanaliculata)在四聚乙醛亞致死濃度脅迫下，乙酰膽堿酯酶活性在福壽螺鰓和腹足內(nèi)呈先升后降趨勢，肝臟和腸內(nèi)活性呈先降后升趨勢。鰓、腸和腹足內(nèi)GSTs活性均呈先降后升再降趨勢。研究結(jié)果表明，茶皂素亞致死濃度(LC20)處理后，蛞蝓體內(nèi)羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性均不同程度受到抑制，且谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶隨處理時間延長，其抑制作用增大。

4 結(jié)論

茶皂素對蛞蝓具有較高的浸殺活性，72 h的亞致死濃度(LC20)為5.123 mg/mL，可有效干擾蛞蝓體內(nèi)SOD、POD、CAT、CarE、AchE和GSTs的活性，擾亂其正常生理代謝功能。