FeSe2納米粒子對膀胱癌T24細(xì)胞的抑制作用及其機制

張健峰 張鵬飛 牛海濤

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 青島 266003)

全球范圍內(nèi)男性膀胱癌的發(fā)病率和死亡率均較高[1]，同時膀胱癌也是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[2]，具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的特點[3]，目前常用的化療、免疫治療等療效也不理想，相關(guān)治療藥物存在特異性低、毒副作用大和半衰期短的問題[4-5]。納米材料因其對腫瘤組織穿透性強[6]、免疫原性低[7]和在血液中循環(huán)時間長[8]等特性，逐漸在腫瘤治療中得以應(yīng)用，也是目前研究的新方向之一。FeSe2是一類重要的過渡金屬二鹵代物，具有優(yōu)異的磁性和近紅外區(qū)的高吸收率的特點，是目前腫瘤光熱治療領(lǐng)域的研究熱點[9-11]。本研究擬設(shè)計合成一種能夠降解谷胱甘肽(GSH)、選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的FeSe2納米粒子，并比較該粒子對膀胱癌細(xì)胞和正常膀胱上皮細(xì)胞的抑制作用，為膀胱癌臨床治療提供新的可能的方式。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞T24細(xì)胞株、人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞所。硒粉購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，氯化亞鐵、乙醇胺、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)購于上海麥克林生化科技有限公司，活性氧(ROS)檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，GSH購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和含10 g/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含有體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

1.3 FeSe2納米粒子的制備

取1 mmol硒粉和1 mmol氯化亞鐵分別溶解于15 mL乙醇胺中，均劇烈磁力攪拌1 h后，將兩者混合，混合物再劇烈磁力攪拌12 h后置于100 mL聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，烘箱中180 ℃反應(yīng)12 h，后自然冷卻至室溫。將混合物以8 000 r/min離心10 min，收集沉淀物并分別用無水乙醇和雙蒸水各洗滌3次，冷凍干燥后得到FeSe2納米粒子粉末[12],取1 mg FeSe2納米粒子溶于1 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制備成濃度為1 g/L的FeSe2母液用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1FeSe2納米粒子表征觀察 采用JEM-2100F型透射電子顯微鏡(TEM)觀察FeSe2的形貌表征，放大倍數(shù)200 000。采用D8 Advance型X射線衍射儀檢測FeSe2的晶體結(jié)構(gòu)表征，掃描范圍為20°～80°，速率為1°/min，步長為0.02°。

1.4.2噻唑藍(MTT)法檢測FeSe2對T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞活性的影響 取處于對數(shù)生長期的T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔約8 000個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入FeSe2母液使其終濃度為0、10、25、50、75、100、200 mg/L。培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉上清液后每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻后置于酶標(biāo)儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度值。計算FeSe2對細(xì)胞活性的抑制率。

1.4.3DTNB法檢測FeSe2與GSH共孵育后GSH含量的變化 在1.5 mL EP管當(dāng)中加入300 μL的GSH(1 mmol/L)，再分別加入0、10、20、30、40、50、60、80 μL的FeSe2母液(1 g/L)，然后使用PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)補至1 mL，使FeSe2終濃度分別為0、10、20、30、40、50、60和80 mg/L，于37 ℃共孵育4 h；同樣，在1.5 mL EP管當(dāng)中加入300 μL的GSH(1 mmol/L)，再加入50 μL的FeSe2母液，用PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)補至1 mL，使FeSe2終濃度50 mg/L，于37 ℃共孵育不同時間(0、2、4、6 h)。孵育完成后在體系中加入10 μL的DTNB乙醇溶液(1.0 g/L)，震蕩混勻室溫下孵育5 min，采用Lambda 950型紫外分光光度計測定412 nm波長處的紫外吸光度值。

1.4.44′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)與2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)雙染檢測T24細(xì)胞內(nèi)ROS水平 取處于對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，胰酶消化后接種于12孔板中，每孔約1×106個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入終濃度5 mg/L的DAPI染料，分別進行如下兩組實驗：①每孔分別加入0、25、50和100 mg/L的FeSe2孵育4 h；②每孔分別加入50 mg/L的FeSe2孵育0、2、4、6 h。孵育結(jié)束后棄掉上清液，每孔再分別加入1 mL無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA熒光探針(10 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中孵育20 min，用無血清DMEM洗滌后，再加入1 mL無血清DMEM，最后置于倒置熒光顯微鏡下，觀察各組T24細(xì)胞的熒光強度。

1.4.5Ferrostatin-1與FeSe2共處理對T24細(xì)胞活性的影響 取處于對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔大約8 000個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁以后，將細(xì)胞分為5組，分別為細(xì)胞對照組(A組)、FeSe2組(B組)、FeSe2+Ferrostatin-1100 nmol/L組(C組)、FeSe2+Ferrostatin-1 200 nmol/L組(D組)、FeSe2+Ferrostatin-1 400 nmol/L(E組)。培養(yǎng)箱孵育24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)，再放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸掉上清液后每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻后置于酶標(biāo)儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度，計算C、D、E組細(xì)胞活性對比B組細(xì)胞活性的相對逆轉(zhuǎn)率。相對逆轉(zhuǎn)率=(C、D、E組吸光度值-B組吸光度值)/ B組吸光度值×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 合成的FeSe2納米粒子的表征

TEM觀察顯示合成的FeSe2納米粒子直徑為10～20 nm(圖1A)，X射線衍射譜圖(XRD)顯示，F(xiàn)eSe2結(jié)晶度高，在θ為34.9°、36.3°和48.2°處有明顯的特征衍射峰(圖1B)。

A：TEM觀察結(jié)果，B：XRD顯示結(jié)果

2.2 FeSe2對T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞的抑制作用

兩因素析因設(shè)計的方差分析顯示，F(xiàn)eSe2的濃度、細(xì)胞類型和FeSe2濃度與細(xì)胞類型的交互作用對T24細(xì)胞活性均具有顯著影響(F濃度=111.30，F(xiàn)細(xì)胞=868.60，F(xiàn)濃度*細(xì)胞=41.47，P<0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示，F(xiàn)eSe2對T24細(xì)胞的抑制作用強于對SV-HUC-1細(xì)胞的抑制作用(F=35.09～294.71，P<0.05)，F(xiàn)eSe2對T24細(xì)胞與SV-HUC-1細(xì)胞的抑制作用則均隨著FeSe2濃度的增高而增強(F=142.74、10.04，P<0.05)。詳見表1。

表1 FeSe2對T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞的抑制率(χ/%)Tab.1 Inhibitory rate of FeSe2 on T24 cells and SV-HUC-1 cells (χ/%)

2.3 FeSe2對GSH的降解作用

DTNB法檢測結(jié)果顯示，將50 mg/L FeSe2與GSH共孵育0、2、4、6 h后，吸光度值分別為0.558±0.017、0.410±0.036、0.167±0.008、0.052±0.011，隨著孵育時間延長，GSH含量逐漸減少，差異具有顯著性(F=240.50，P<0.05)。0、10、20、30、40、50、60和80 mg/L濃度的FeSe2與GSH共孵育4 h后，吸光度值分別為0.616±0.036、0.485±0.024、0.448±0.021、0.414±0.018、0.359±0.011、0.185±0.013、0.151±0.016、0.130±0.011，并隨著FeSe2濃度的增大，GSH含量逐漸減少，差異均具有顯著意義(F=153.60，P<0.05)。

2.4 FeSe2對T24細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

DAPI與DCFH-DA雙染結(jié)果顯示，DAPI進入細(xì)胞后定位于細(xì)胞核內(nèi)，使用405 nm激光激發(fā)后發(fā)出藍色熒光，DCFH-DA進入細(xì)胞后與ROS反應(yīng)生成2′,7′-二氯熒光素(DCF)，使用488 nm激光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光(圖2)。圖中顯示，不同時間和不同濃度處理的T24細(xì)胞內(nèi)均可見藍色熒光和綠色熒光，且隨著FeSe2濃度增高或作用時間延長，藍色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強。

DAPI與DCFH-DA雙染，40倍，標(biāo)尺=50 μm圖2 不同濃度和不同時間FeSe2對T24細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effect of FeSe2 with different concentrations and treatment times on ROS level in T24 cells

2.5 Ferrostatin-1與FeSe2共處理對T24細(xì)胞活性的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D、E組吸光度值分別為0.470±0.027、0.184±0.008、0.215±0.013、0.247±0.014、0.274±0.011，各組細(xì)胞的吸光度值比較差異具有顯著性(F=194.80,P<0.05)。其中A組與B組比較、B組與C、D、E組間比較，差異均有顯著性(P<0.05)。FeSe2和Ferrostatin-1共處理的C、D、E組細(xì)胞活性對比B組細(xì)胞活性的相對逆轉(zhuǎn)率分別為22.28%、34.24%、48.91%，隨著Ferrostatin-1濃度的升高，對FeSe2作用于T24細(xì)胞抑制作用的逆轉(zhuǎn)率也越高(F=43.81,P<0.05)。

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第1位，在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌[1]。膀胱癌分為肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)和非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)[13-14]。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)為主，或同時聯(lián)合其他方式的綜合治療[15],但70%～80%的NMIBC患者在術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)或進展[16]，10%～20%的患者進展為MIBC或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性疾病[17]；放療及化療的副作用較大，缺乏選擇性[4-5]；目前新興的二線治療如免疫治療和靶向治療，則因價格昂貴和患者反應(yīng)率低，而不能被廣泛接受[18-20]。

納米材料因穿透腫瘤組織能力強、免疫原性低和在血液中循環(huán)時間長等特性，成為腫瘤治療的新方向之一。ROS是指在生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的、含氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱。低濃度的ROS在調(diào)節(jié)信號通路、消除病原體、調(diào)節(jié)炎癥以及促進細(xì)胞增殖等方面具有重要作用，然而當(dāng)ROS濃度較高時則可能破壞核酸、蛋白質(zhì)或細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[21]。GSH是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化物之一，其能夠保護細(xì)胞免受ROS損傷[19-20]。腫瘤細(xì)胞的ROS水平往往高于正常細(xì)胞，導(dǎo)致體內(nèi)如GSH的抗氧化劑水平適應(yīng)性升高，使ROS和GSH在高水平保持動態(tài)平衡，且傾向于呈現(xiàn)為氧化應(yīng)激的狀態(tài)[22-23]。

本研究以乙醇胺為溶劑，用氯化亞鐵和硒粉一步水熱法合成了FeSe2納米粒子，該粒子TEM表征顯示直徑為10～20 nm，符合納米藥物的尺寸要求；XRD表征顯示，在θ為34.9°、36.3°和48.2°處有特征衍射峰，與FeSe2的JCPDS 21-0432數(shù)據(jù)一致，表明成功合成FeSe2晶體。通過MTT法比較FeSe2對T24細(xì)胞和SV-HUC-1細(xì)胞活性的抑制作用，結(jié)果顯示，F(xiàn)eSe2針對T24細(xì)胞活性的抑制作用強于對SV-HUC-1細(xì)胞活性的抑制作用。為進一步探究可能的機制，將FeSe2與GSH共孵育，以DTNB檢測GSH含量，結(jié)果顯示FeSe2可降解GSH，且降解量隨著濃度的增加或時間的延長而增加。DAPI與DCFH-DA雙染結(jié)果顯示，隨著FeSe2濃度增高或作用時間延長，藍色熒光逐漸減弱，表明FeSe2可抑制T24細(xì)胞活性，與MTT結(jié)果相符；綠色熒光逐漸增強，表明FeSe2能夠誘導(dǎo)T24細(xì)胞ROS升高，且ROS水平與FeSe2的濃度和作用時間均呈正相關(guān)。因此FeSe2對膀胱癌T24細(xì)胞的抑制作用可能與降解GSH導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的水平升高密切相關(guān)。FeSe2對T24細(xì)胞活性的抑制作用明顯強于對SV-HUC-1細(xì)胞的抑制作用，則可能是因為腫瘤細(xì)胞的ROS濃度明顯高于正常細(xì)胞，使用外源性試劑增加氧化應(yīng)激對腫瘤細(xì)胞的破壞性比對正常細(xì)胞的破壞性更大。即腫瘤細(xì)胞中本身固有的ROS濃度較高，當(dāng)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都暴露于相同量的外界ROS時，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平將更容易達到觸發(fā)細(xì)胞死亡的閾值；而正常細(xì)胞固有的ROS濃度低，因此能夠緩沖一定量的ROS而不至于觸發(fā)細(xì)胞死亡[24]。

鐵死亡是鐵依賴性的，由過度脂質(zhì)過氧化引起，是伴隨GSH耗竭和ROS爆發(fā)的一種細(xì)胞死亡方式[25]。Fe2+在鐵死亡過程中起著重要推動作用，當(dāng)它與H2O2混合并發(fā)生反應(yīng)時，可以產(chǎn)生自然界中氧化性僅次于氟的羥基自由基[26]。本研究中合成的FeSe2含有Fe2+，能夠降解GSH，產(chǎn)生ROS，因此很可能參與了鐵死亡介導(dǎo)細(xì)胞死亡的過程。腫瘤細(xì)胞的H2O2水平高于正常細(xì)胞[27]，因此相同濃度的FeSe2能夠產(chǎn)生更多的羥基自由基，這也可能是導(dǎo)致FeSe2對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞抑制作用不同的原因。進一步的實驗證明，隨著Ferrostatin-1濃度增大，逆轉(zhuǎn)FeSe2對T24細(xì)胞抑制作用的效應(yīng)逐漸增強，提示FeSe2可能是通過觸發(fā)鐵死亡從而導(dǎo)致對T24細(xì)胞活性的抑制作用。

綜上所述，F(xiàn)eSe2可以消耗胞外GSH，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，可能參與鐵死亡的過程，從而抑制T24細(xì)胞的活性，有望用于膀胱癌治療。而這還需進一步的動物實驗和前瞻性臨床研究來進行驗證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：牛海濤、張鵬飛、張健峰參與了研究設(shè)計；牛海濤、張健峰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byNIUHaitao,ZHANGPengfei, andZHANGJianfeng. The manuscript was drafted and revised byNIUHaitaoandZHANGJianfeng. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.