美國薄殼山核桃細菌性葉枯病研究進展

曹凡 王瑩 郭聰 陳燕 李玉娟

摘要：薄殼山核桃是高檔干果樹種，不僅經濟效益高，也是優(yōu)良的行道樹和庭蔭樹，適于河流沿岸、湖泊周圍及平原地區(qū)“四旁”綠化，具有極大的應用研究價值。薄殼山核桃細菌性葉枯病是由木質部難養(yǎng)菌引起的，可導致病株嚴重落葉、堅果質量和果仁質量下降，造成巨大的產量損失。本文從薄殼山核桃細菌性葉枯病的病原概述、病癥表現及檢測手段等方面進行綜述，以期對該病害有更全面的了解，并且針對今后檢測技術、防治措施及抗病品種培育等研究方向提出合理化建議，旨在為我國薄殼山核桃成熟果園病害防治研究提供參考。

關鍵詞：美國山核桃;木質部難養(yǎng)菌;酶聯免疫法;熒光定量PCR;細菌性葉枯病

中圖分類號：S436.64 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0018-04

收稿日期：2020-11-05

基金項目：江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號： CX（19）3121]。

作者簡介：曹 凡（1990—），男，江蘇南通人，博士，主要從事經濟林育種與栽培研究。E-mail： caofan90@126.com。

通信作者：李玉娟，副研究員，主要從事觀賞苗木育種與栽培技術研究。E-mail： lyglyj90@sohu.edu.cn。

薄殼山核桃（Carya illinoinensis）為胡桃科山核桃屬，原產于北美洲，別稱美國山核桃、長山核桃等，英文名為pecan，俗稱碧根果，是世界上重要的果、油、材、林兼用的多用途、多效益木本植物之一[1-2]。薄殼山核桃在食品加工、藥用功能、木材用料、園藝栽培等多個方面都有著極高的應用價值[3]。根據美國農業(yè)部對外農業(yè)服務部門海外農業(yè)服務局（FAS）的數據，自2012年以來，美國的薄殼山核桃全球出口量增長了30%以上。除了其原產地以外的國家，中國、南非、澳大利亞、烏拉圭、阿根廷和巴西等國家和地區(qū)，目前都在規(guī)?；?、產業(yè)化地引進種植薄殼山核桃，預計未來30年在全世界范圍內，薄殼山核桃產量會不斷增加[4-7]。

細菌性葉枯病（bacterial leaf scorch，PBLS），別稱細菌性葉焦病或葉灼病，是影響薄殼山核桃的一種重要病害，該病害已經被證實發(fā)生在美國東部和南部，包括加利福尼亞州、佐治亞州、路易斯安那州、德克薩斯州、新墨西哥州和亞利桑那州[8-9]。細菌性葉枯病會導致薄殼山核桃易感病品種在生長季結束前50%的樹冠葉片過早脫落，這也導致了其果園產量損失超過450美元/hm2[10]。此外，該病害也會對來年開花和隔年結果產生影響。因此，細菌性葉枯病被認為是在世界范圍內傳播的一個新興問題[11]。關于薄殼山核桃細菌性葉枯病，美國農業(yè)部、佐治亞大學、德州農工大學、新墨西哥大學等多個研究機構的植物病理專家學者都有相關研究報道[12]。本文擬對美國薄殼山核桃細菌性葉枯病方面的研究工作進行綜述，旨在為今后我國薄殼山核桃成熟果園病害防治研究提供參考。

1 病原概述

薄殼山核桃葉枯病根據病原不同可分為細菌性病害和真菌性病害。其中，薄殼山核桃細菌性葉枯病是由木質部難養(yǎng)菌（Xylella fastidiosa）引起的，這是一種習居于木質部維管的細菌?！癋astidious”意為其存在復雜的營養(yǎng)需求，很難用常規(guī)細菌學方法進行培養(yǎng)。而木質部維管也表明了其機體活動受植物木質部的限制。木質部難養(yǎng)菌寄居于植物根、莖、葉等木質部，可以通過阻塞植物導管內養(yǎng)分與水分的運輸，從而引起植物葉片枯斑、萎黃、果實萎蔫，甚至導致植株死亡。

木質部難養(yǎng)菌作為病原其導致最為嚴重的病害是葡萄皮爾斯病。在1892年，葡萄皮爾斯病給美國加州南部數萬公頃的葡萄園造成了毀滅性的損害[13]。一直到1973年，木質部難養(yǎng)菌與其關聯的葡萄皮爾斯病才一同被研究報道[14]。自此之后，各類研究發(fā)現超過20種以上的植物病害與木質部難養(yǎng)菌有關，涉及至少309個植物種類，如杏、榆、櫟、懸鈴木、桑等的葉焦病，紫花苜蓿的矮縮病，李的葉灼病及柑橘的雜色褪綠病等。1997年，薄殼山核桃細菌性葉枯病由木質部難養(yǎng)菌作為病原被正式報道[15]。2015年，在美國全國山核桃作物咨詢委員會的會議上，薄殼山核桃細菌性葉枯病被正式確定為國際上薄殼山核桃行業(yè)的一個新興問題。

2 癥狀表現

2.1 病害癥狀

細菌性葉枯病主要是因為木質部難養(yǎng)菌阻礙了薄殼山核桃樹體內水分與養(yǎng)分的輸送，導致樹體葉片焦黃、萎蔫和過早凋落。焦斑首先會出現在小葉邊緣，然后向葉片中脈感染。葉片感染的區(qū)域可以通過肉眼清楚界定，葉片上的壞死組織與健康組織之間有深色的邊緣。葉片癥狀表現以及落葉的情況通常出現在老枝小葉上，或是僅受限于單一枝條，或是整個植株都有該病癥表現，受感染的病株每年都會有不同程度的癥狀表現。細菌性葉枯病通常在生長季中后期表現，主要在6—8月份出現。當薄殼山核桃種植園內的果樹處于較大負載，或是干旱脅迫，或是其他脅迫條件下，木質部難養(yǎng)菌所導致的細菌性葉枯病則更加嚴重。

2.2 傳播方式

導致薄殼山核桃細菌性葉枯病傳播的方式有很多種，其中最主要的一種傳播方式是昆蟲傳播。以美國本土沫蟬、葉蟬等以薄殼山核桃木質部為食的昆蟲，可以將其自身攜帶的木質部難養(yǎng)菌通過取食處傷口直接傳播至植株體內。除此之外，嫁接也是一種接穗與砧木之間相互傳播木質部難養(yǎng)菌的方式，研究發(fā)現感染接穗有21%概率傳染未感染砧木，而感染砧木有85%概率傳染未感染接穗。另外，通過對感染母株果實內木質部難養(yǎng)菌的檢測，發(fā)現母株攜帶的木質部難養(yǎng)菌可以傳播給子代。

2.3 感病品種

薄殼山核桃早熟品種凱普·費爾（Cape Fear）因其種子極高的飽滿度和果仁極佳的金黃色澤而一度受到種植者的推崇，但是它被證實是細菌性葉枯病的易感品種[10]。目前，Cape Fear因細菌性葉枯病造成的損失被分析研究，其也成為了研究薄殼山核桃細菌性葉枯病的代表品種。細菌性葉枯病是影響薄殼山核桃正常生長的一種較新發(fā)現的病害，其具體的發(fā)生情況與潛在危害尚有很多待進一步研究的方面。薄殼山核桃不同品種之間，對于細菌性葉枯病感染的嚴重程度也有所不同。研究發(fā)現，約有20多種薄殼山核桃品種易受木質部難養(yǎng)菌感染而導致葉枯病，其中Cape Fear被認為與細菌性葉枯病的關聯性最大。在受到細菌性葉枯病感染最嚴重的地區(qū)，受到感染的Cape Fear果樹較未感染的植株在生長季末期的落葉量增加了58%，總質量下降24%，果實質量下降10%～13%，果仁質量下降14%～19%，總產量下降約12%，果園產量總損失超過466美元/hm2。而細菌性葉枯病對于其他薄殼山核桃品種造成的經濟損失尚不確定。根據美國農業(yè)部薄殼山核桃育種中心的觀測清理，目前尚未發(fā)現對細菌性葉枯病抗性較強的薄殼山核桃優(yōu)良品種，包括美國本土野生的薄殼山核桃也屬于易感染類型。除了Cape Fear之外，巴頓（Barton）、夏延（Cheyenne）、奧克尼（Oconee）、波尼（Pawnee）、羅馬（Rome）和薩姆納（Sumner）等都是易感細菌性葉枯病的薄殼山核桃品種。

3 檢測手段

薄殼山核桃除了真菌引進的真菌性葉枯病之外，其他方面的問題也能導致病株表現出類似于細菌性葉枯病的相關癥狀，如棉根腐病引起的已死亡枯萎葉片仍長時間滯留枝頭;樹體邊緣葉片因鹽毒害導致的細胞組織壞死;黑蚜蟲或螨蟲等蟲害引起的薄殼山核桃葉片葉焦;N或K等元素不平衡引起的葉片枯斑。因此，針對病株選擇合適的檢測方法尤為重要。目前，薄殼山核桃葉枯病的檢測方法主要有2種，一種是基于血清學研究的酶聯免疫法（ELISA）檢測，另一種是基于分子生物學的聚合酶鏈式反應（PCR）或實時熒光定量PCR（qPCR）方法。

3.1 ELISA檢測

酶聯免疫吸附測定是將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。薄殼山核桃細菌性葉枯病的ELISA檢測方法主要是雙抗體夾心法，即先加入已知抗體包被于載體表面，之后加入檢測樣品提取液與抗體結合，再加入加酶標抗體與抗原結合，最終加酶作用的底物會產生顯色反應。通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量成正比。根據美國德州農工大學植物病理與微生物學院Hilton博士針對木質部難養(yǎng)菌的改進檢測方法試驗，樹液、葉片組織、葉柄基部等不同植物材料粗提液的ELISA檢測結果基本一致，其中以薄殼山核桃樹液作為檢測材料的效果最佳[16]。

3.2 PCR/qPCR檢測

木質部難養(yǎng)菌一般很難從寄主植株中分離，尤其是對于沒有任何癥狀表現的寄主植株的檢測鑒定就更加困難[17-18]，而當寄主植物或昆蟲介體木質部難養(yǎng)菌攜帶量很低時，傳統(tǒng)分離法或是酶聯免疫吸附法都不能有效檢測病原菌。因此，采用PCR/qPCR等分子檢測手段十分重要[19]。PCR是檢測、診斷和鑒定植物病原細菌最有效的手段之一[20]，而qPCR （real-time PCR）是靈敏度及可靠性高的PCR 技術，較傳統(tǒng)PCR更為快速，能定量檢測樣品中的病原菌。隨著木質部難養(yǎng)菌重要菌株測序的完成，基于其基因組信息設計的PCR檢測方法也相繼被報道[21-25]。此外，還有一些基于種水平上的PCR或實時熒光定量PCR檢測方法也已有相關報道[26-30]。根據Hilton博士針對木質部難養(yǎng)菌的改進檢測方法試驗，薄殼山核桃樹液粗提液和全DNA提取液的PCR/qPCR檢測效果較好，并且其改良的qPCR技術檢測效率可達到94%[16]。

3.3 檢測研究進展

目前，美國薄殼山核桃葉枯病檢測方面的研究主要集中于各個州薄殼山核桃果園的地方性檢測[12]。筆者在美國德州農工大學訪學期間，針對已感染的薄殼山核桃果子與新生幼苗內的木質部難養(yǎng)菌進行數個檢測基礎試驗。針對薄殼山核桃品種艾略特（Elliott），分別對其的根、莖和小葉進行木質部難養(yǎng)菌gDNA的ELISA檢測，結果表明根和小葉樣品中含有大約相等濃度的木質部難養(yǎng)菌gDNA，而莖部樣品中gDNA濃度最高。關于薄殼山核桃Cape Fear果仁各個部位解剖結構（胚部、韌皮部、維管膜和外膜）的木質部難養(yǎng)菌濃度qPCR檢測試驗，結果發(fā)現果仁外膜的木質部難養(yǎng)菌濃度最高。此外，關于薄殼山核桃果實密度與木質部難養(yǎng)菌濃度的關系研究中，細菌濃度隨著堅果密度的增加而增加，而實際薄殼山核桃卡多（Caddo）果園中有葉枯病癥狀果樹堅果的密度明顯低于無癥狀果樹，該試驗結果的矛盾之處有待進一步深入試驗論證。

4 防治方法

目前，薄殼山核桃細菌性葉枯病還沒有特別有效的控制方法[31]。針對薄殼山核桃細菌性葉枯病，可以從增強樹勢和控制病原2個方面考慮防治方法。

4.1 增強樹勢

通過采用嚴格管控的方式，如間伐、疏果和水肥管理等方面的調控，為果園內的果樹增強樹勢，緩解逆境脅迫壓力，可以減少細菌性葉枯病所造成的損害。通常來說，越健康的薄殼山核桃樹就越能夠有效地應對各類真菌或細菌的侵害。

4.2 控制病原

此外，果園內的薄殼山核桃應該盡量避免接觸其他受污染的植物材料，這也是防治木質部難養(yǎng)菌感染的一種方式。新建果園除了要考慮立地條件外，也要對種植薄殼山核桃嫁接苗的砧木與接穗進行篩選處理。研究表明，薄殼山核桃接穗通過熱水處理的方式，97%可以防止木質部難養(yǎng)菌的傳播[32-33]。

5 研究展望

針對薄殼山核桃葉枯病的研究方向，今后主要可以從檢測技術、防治措施及抗病品種培育等方面進行深入研究。

5.1 檢測方式改良

因為薄殼山核桃無癥狀的果樹也可能是木質部難養(yǎng)菌的宿主，往往單一形式的檢測方式并不能得到有效的檢測結果，所以采用多個檢測方法共同驗證是未來發(fā)展的趨勢。此外，檢測過程中也出現了檢測結果假陰性或假陽性的問題，這也將依賴于今后技術革新，以期改良出精準、有效的檢測技術。影響薄殼山核桃病害的原因很多，包括各種蟲害、真菌、細菌及其他非生物脅迫。只有通過真正有效地進行檢測，才能更好地采取最佳方式處理應對。

5.2 攜菌昆蟲防治

針對薄殼山核桃細菌性葉枯病，昆蟲攜帶的防治研究將是一個重要的研究領域[12]。研究發(fā)現，以美國東南部常見的沫蟬為例，通過其取食薄殼山核桃而導致的木質部難養(yǎng)菌傳播率達到11.4%[34]。目前，我國國內薄殼山核桃果園因為生物脅迫導致的病害已經達到需要引起重視的地步。國內引起薄殼山核桃蟲害的昆蟲除了天牛之外，還有葉甲、木蠹蛾、金龜子、刺蛾、葉峰、潛葉蠅、警根瘤蚜、桃蛀螟、椿象、緣蝽等。因此，針對木質部難養(yǎng)菌攜帶昆蟲觀測，并且采取有效的物理、化學及生物防治手段是防控薄殼山核桃細菌性病害的重點方向。

5.3 抗病品種篩選

木質部難養(yǎng)菌薄殼山核桃抗病品種的篩選應該分別從砧木和接穗2個角度展開。關于薄殼山核桃接穗優(yōu)良品種的傳統(tǒng)篩選，需要考慮的包括：果實持續(xù)高品質、早收、高產、大小年異化程度低、晚萌芽、抗瘡痂病和蚜蟲抗性等多個特點。針對于薄殼山核桃葉枯病，新建果園嫁接苗種植應避免選用Cape Fear等較易感染的品種，育苗嫁接或老園嫁接改造時可對接穗進行特殊處理。此外，薄殼山核桃的嫁接樹生長受自身復雜的遺傳系統(tǒng)的影響，而其遺傳系統(tǒng)由砧木和接穗共同決定[35]。研究發(fā)現，北美的葡萄品種相較歐洲的葡萄品種的根部具有極強的葡萄根瘤蚜抗性而以北美葡萄作為砧木嫁接的歐洲葡萄品種不再易感葡萄根瘤蚜[36]。因此，關于抗病砧木的篩選也是未來重要的研究方向。

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