微小RNA-302c在高糖下對人腎小球系膜細(xì)胞的影響

朱艷，胡宇夢，劉釋文，江芳芳，盛霞，余愛清，王群，劉玉婷，秦淑蘭,

（1.中山大學(xué)附屬南昌醫(yī)院內(nèi)分泌科，南昌330008；2.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州510900；3.大連海事大學(xué)，大連116026）

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是世界上慢性腎臟病的主要病因[1]，也是我國患者血液透析的第二大原因，對糖尿病死亡率有顯著影響[2]。細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換受金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）活性的調(diào)節(jié)。金屬蛋白酶組織抑制因子-3（tissue inhibitors of metallo proteinase-3，TIMP3）是腎臟中表達(dá)最高的TIMP，研究表明在糖尿病情況下，腎臟中TIMP3的表達(dá)顯著減少，并與小鼠的炎癥、腎纖維化和腎小球系膜細(xì)胞凋亡有關(guān)[3-5]。但目前高糖下調(diào)控TIMP3表達(dá)的確切機(jī)制尚不明確[6]。前期研究我們通過使用TargetScan靶基因預(yù)測軟件，選擇靶基因中富集參與調(diào)控細(xì)胞增殖和生長的mi RNAs對TIMP3進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-302c可能調(diào)控TIMP3的表達(dá)。因此，本研究中我們將進(jìn)一步探討高糖環(huán)境下mi R-302c是否調(diào)控人腎小球系膜細(xì)胞TIPM3的表達(dá)及其對人腎小球系膜細(xì)胞生存的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設(shè)備 人腎小球系膜細(xì)胞（HRMCs）（購自ScienCell公司）；MCM全套培養(yǎng)基（ScienCell），0.25%Trypsin-EDTA（Gibco），葡萄糖（Sigma），Trizol（Invitrogen），Recombinant DNase I（RNase-free，TaKaRa），Reverse transcriptase MMLV（RNase H），RNase Inhibitor（TaKaRa），SYBR Green Supermix（Bio-RAD），SYBR green(Invitrogen公 司)，NanoDrop 2000光 譜 儀 (Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，倒置顯微鏡（日本Nikon TS100），細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Thermo），無菌操作臺（LABGARD CLASSⅡ），PCR儀（ABI 9700），實(shí)時熒光定量基因檢測系統(tǒng)（Roche 480）。

1.2 方法

1.2.1 熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證TIMP3是否為mi R-302c的直接靶基因，我們構(gòu)建了熒光素酶報告基因pmiR-TIMP3-WT(H13064)和pmiRTIMP3-MUT(H13065)，進(jìn)行了熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取人腎系膜細(xì)胞3×106個/mL，在MCM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞每4天傳代一次，傳代至第9代。然后使用正常葡萄糖（5 mM D-glucose）或高葡萄糖(30 mM D-glucose)培養(yǎng)細(xì)胞48 h、72 h和96 h。

1.2.3 采用qRT-PCR檢測miR-302c和TIMP3 mRNA的表達(dá) 正常或高糖下培養(yǎng)細(xì)胞，48 h后，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。使用NanoDrop 2000光譜儀測定RNA的數(shù)量和質(zhì)量，采用SYBR green定量檢測miR-302c和TIMP3 mRNA的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h、96 h后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，取10μL懸液置于新的1.5 mL離心管中，加入10μL臺盼藍(lán)染液，使用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.5 采用qRT-PCR檢測IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá) 在正常和高糖條件下分別培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，48 h后，提取細(xì)胞總RNA，使用qRT-PCR法檢測IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 TIMP3是miR-302c的直接靶基因 熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-302c能特異性地與TIMP-3-3’UTR結(jié)合，抑制其熒光素酶活性，驗(yàn)證了TIMP-3是miR-302c的直接靶基因（圖1）。

圖1 熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)：miR-302c能特異性地與TIMP-3-3’UTR結(jié)合，抑制其熒光素酶活性，驗(yàn)證了TIMP-3是miR-302c的直接靶基因（***P＜0.001 vs對照組）。

2.2 高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞miR-302c及TIMP3 mRNA的表達(dá) 分別以正常糖（NG，5mM D-glucose）與高糖（HG，30mM D-glucose）培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與正常糖培養(yǎng)的細(xì)胞相比較，高糖培養(yǎng)48 h后，miR-302c表達(dá)顯著性升高，其靶基因TIMP-3 mRNA表達(dá)顯著性降低 (P＜0.01)（圖2）。

圖2 人腎小球系膜細(xì)胞在不同糖濃度培養(yǎng)48 h后的miR-302c以及TIMP-3 mRNA表達(dá)（NG:正常糖HG:高糖；**P＜0.01 vs NG）。

2.3 高糖對人腎小球系膜細(xì)胞存活的影響 為了探究高糖處理對人腎小球系膜細(xì)胞存活的影響，本研究分別用正常糖組（5 mM D-glucose）和高糖組（30 mM D-glucose）處理細(xì)胞，培養(yǎng)42 h、72 h以及96 h后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖3所示,與正常糖組相比，高糖處理組細(xì)胞存活率顯著性降低(P＜0.05)。

圖3 與正常糖培養(yǎng)相比較，30 mMGlu(+)高糖培養(yǎng)后，人腎小球系膜細(xì)胞數(shù)顯著性減少。（NG:正常糖HG:高糖；*P＜0.05 VS NG**P＜0.01 VS NG）。

2.4 高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞的炎癥因子表達(dá) 采用qRT-PCR技術(shù)測定高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示,與正常糖組相比，高糖處理組的腎小球系膜的IL-6 mRNA（P＜0.05）和IL-8 mRNA（P＜0.05）表達(dá)水平顯著性升高。

圖4 與正常糖培養(yǎng)相比較，30 mMGlu(+)高糖培養(yǎng)后，人腎小球系膜細(xì)胞的炎癥因子IL-6以及IL-8表達(dá)顯著性升高。（NG:正常糖HG:高糖；*P＜0.05 VS NG）。

3 討論

DN是最常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，約占慢性腎衰竭病因的45%[7]。截止目前，各種干預(yù)措施僅部分有效，不能阻斷腎病進(jìn)展[8]。因此，進(jìn)一步探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，尋找預(yù)防和治療DN的有效方法對于我國健康衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展具有深遠(yuǎn)而重大的指導(dǎo)意義。

MMPs和TIMPs的平衡決定了系膜細(xì)胞外基質(zhì)的完整性。在糖尿病情況下，腎臟中TIMP3的表達(dá)顯著性降低，并促使腎小球系膜細(xì)胞凋亡。例如，Lai等[9]研究顯示在印第安糖尿病腎病患者中TIMP3表達(dá)下調(diào)，通過抑制TGF-β/Smad信號通路促使患者系膜細(xì)胞凋亡及足突細(xì)胞損失。Fiorentino等[5]研究報道糖尿病腎病患者腎活檢結(jié)果證實(shí)TIMP3表達(dá)顯著下降，其可通過FoxO1/STAT1信號途徑導(dǎo)致患者系膜細(xì)胞凋亡、腎臟組織基底膜增厚、系膜擴(kuò)張及蛋白尿增加。Basu等[10]報道TIMP3表達(dá)下調(diào)將促使系膜細(xì)胞凋亡，使得糖尿病腎病惡化。Menghini等[11]的研究發(fā)現(xiàn)TIMP3可通過抑制NH2-terminal和P38激酶活化，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激及抑制TNF-α釋放，從而抑制細(xì)胞的凋亡。上述研究結(jié)果提示TIMP3是一個多功能因子，TIMP3表達(dá)下調(diào)可以從多方面參與糖尿病腎臟的病理變化過程，然而調(diào)控TIMP3表達(dá)的因素尚未闡明。

miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA分子，能與靶基因3’非編碼區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致靶mRNA降解和翻譯阻遏[12]。既往有研究顯示TIMP3的表達(dá)水平受miRNA調(diào)控。MiR-770-5p通過靶向調(diào)控TIMP3促進(jìn)糖尿病腎病足細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[13]；miR-21的下調(diào)通過靶向上調(diào)TIMP3，抑制炎癥反應(yīng)以及足細(xì)胞的凋亡[14]；在糖尿病腎病系膜細(xì)胞中，TIMP3與miR-181b表達(dá)呈負(fù)調(diào)控關(guān)系[15]。 前期研究中我們通過TargetScan7.2靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-302c與TIMP3的表達(dá)可能相關(guān)。

miR-302屬于miR-302/367家族，人源miR-302/367位于4號染色體q25區(qū)，包括miR-302a/b/c/d和miR-367等成員[16]。許多研究報道m(xù)iR-302在腫瘤生長、肺纖維化及干細(xì)胞蛋白表達(dá)等各類生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用[17-18]，此外，部分學(xué)者證實(shí)miR-302與糖尿病腎病具有一定的相關(guān)性，F(xiàn)aherty等[19]發(fā)現(xiàn)miR-302的表達(dá)增加，可靶向TGFβ-II型受體，與腎病細(xì)胞表型密切相關(guān)，Chengjie等[20]報道m(xù)iR-302b過度表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，在DN的發(fā)生發(fā)展中起到保護(hù)作用。De等[21]發(fā)現(xiàn)mi R-302可通過調(diào)節(jié)SNAI1的表達(dá)，調(diào)控系膜細(xì)胞的可塑性。本研究中我們進(jìn)行了雙熒光素酶報告分析，結(jié)果表明，TIMP3是miR-302c的直接靶基因，miR-302c水平與TIPM3的表達(dá)呈負(fù)反饋調(diào)控。因此，我們認(rèn)為miR-302c可能通過對TIMP3的調(diào)控影響系膜細(xì)胞的生物活性，與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

本研究觀察到在高糖環(huán)境下，系膜細(xì)胞miR-302c表達(dá)增加，TIMP3的表達(dá)水平下降，同時人系膜細(xì)胞存活率下降。眾所周知，系膜細(xì)胞凋亡與細(xì)胞炎癥機(jī)制激活密切相關(guān)[22]，并涉及JAK/STAT,NF-κB以及Nrf-2等多種信號通路[23-26]。炎癥介質(zhì)的生成也受mi RNA調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)miRNA-302e可通過抑制NF-κB信號通路活化在過敏性疾病中發(fā)揮抗炎作用[27]，并可通過RelA/BRD4/NF-κB信號途徑減輕小兒肺炎的炎癥反應(yīng)[28]。mi R-302d抑制劑可通過抑制軟骨細(xì)胞IκBα和p65的磷酸化，從而減輕軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少軟骨細(xì)胞的凋亡[29]。mi R-302c可調(diào)節(jié)人體CD4+CD45RO+T淋巴細(xì)胞中IL-21的表達(dá)[30]。在胃癌細(xì)胞中，mi RNA-302c可調(diào)控炎癥因子IL-8的表達(dá)[31]。此外，TIMP3作為炎癥中的關(guān)鍵介質(zhì)，可調(diào)控促炎癥通路的關(guān)鍵酶的表達(dá)[32]。研究發(fā)現(xiàn)TIMP3是腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶（TACE）的唯一生理抑制劑，它的缺失增強(qiáng)TNF-α信號途徑進(jìn)而引起腎小管間質(zhì)損傷[33]。TIMP3過表達(dá)可顯著抑制高糖處理的足細(xì)胞IL-1β和TNF-α的釋放，改善細(xì)胞的炎癥狀態(tài)及凋亡[13,34]。在本研究中，我們進(jìn)一步檢測了炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下，系膜細(xì)胞存活率下降的同時，細(xì)胞的IL-6以及IL-8 mRNA的表達(dá)顯著性增加。

綜上所述，本研究首次報道了miR-302c可靶向負(fù)調(diào)控TIMP3的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞的mi R-302c表達(dá)上調(diào)、TIMP3 mRNA表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞存活率降低，同時系膜細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)增高。本研究可為闡明miR-302c在DN發(fā)病中的作用及為臨床治療DN提供一定的理論依據(jù)。當(dāng)然，我們研究仍存在不足之處，未進(jìn)一步探討在高糖環(huán)境中過表達(dá)或抑制miR-302c之后人腎小球系膜細(xì)胞TIMP3 mRNA的表達(dá)水平，以及細(xì)胞的存活率；未進(jìn)一步闡述miR-302c靶向負(fù)調(diào)控TIMP3是通過哪些信號通路作用于系膜細(xì)胞。