一種氨基哌嗪功能化的丹磺酰氯熒光衍生試劑的合成及其在高效液相色譜法定量分析微藻油脂中的應用

郭子嫻，蔣 妍，全紅花，李 明

(揚州大學 環(huán)境科學與工程學院,揚州 225127)

微藻是一種廣泛分布于海洋、淡水中的單細胞生物[1],其中富含的油脂是重要的生物質燃料[2],不同種類微藻中油脂的組成及含量相差較大[3-6]。目前,相關測定方法有衍生化-氣相色譜法、近紅外光譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法。衍生化-氣相色譜法對熱敏感物質影響較大[7],近紅外光譜法操作較難以及所需樣品量較大[8],毛細管電泳法的表面電滲變化對分離重現(xiàn)性影響較大[9],而附熒光檢測器的高效液相色譜法(FLD-HPLC)的分離度及靈敏度較高,適用于不同脂肪酸衍生物的分析[10-11]。脂肪酸由于不具有熒光特性,需要通過熒光衍生試劑與脂肪酸反應生成熒光衍生物來實現(xiàn)檢測[12]。常見的熒光衍生試劑有溴甲基類、哌嗪類、重氮甲烷類、氨基類化合物等[13-14]。丹磺酰氯(DNS-CL)是常用的氨基化合物熒光衍生試劑的原料,具有靈敏度高的優(yōu)點[15-17]。但DNS-CL 不能直接用于脂肪酸的衍生化。

鑒于此,本工作制備了二甲基氨基哌嗪功能化的DNS-CL 熒光衍生試劑(DNS-Pi-NH2),并用其衍生化小球藻中碳原子為10～20 的脂肪酸,用FLD-HPLC測定脂肪酸衍生物的含量,以期為微藻中碳原子數(shù)為10～20的脂肪酸含量的準確測定提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

L-2000型高效液相色譜儀;Bojin C18固相萃取柱(2 000 mg/12 mL);RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀;Cary 610/670型顯微紅外光譜儀;AVANCE 600型核磁共振波譜儀;ma Xis型超高分辨飛行時間質譜儀,配電噴霧離子(ESI)源。

單標準儲備溶液:2.5×10－4mol·L－1,取適量各脂肪酸標準品,用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解并定容至10.0 mL容量瓶中,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量脂肪酸單標準儲備溶液,用DMF 逐級稀釋,配制成2.0×10－10,2.0×10－9,2.0×10－8,2.0×10－7,2.0×10－6,2.0×10－5,2.0×10－4mol·L－1混合標準溶液系列。

十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸和二十烷酸標準品的純度均大于98%;順-9-十八(碳)烯酸、順-9,12-十八(碳)烯酸、順-7,10,13-十六(碳)烯酸標準品的純度均大于85%;硬脂酸甲酯標準品的純度大于97%;DMF的純度大于99.5%;DNS-CL、N-(2-氨乙基)哌嗪的純度均大于99%;三苯基膦(TPP)的純度大于95%;二丙基二硫醚(DPDS)的純度大于98.0%;試驗用水為去離子水。

小球藻(微藻的一種)脂肪酸甲酯樣品由韓國浦項科技大學微流控應用化學中心提供。

1.2 儀器工作條件

Eclipse XDB C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為90%(體積分數(shù),下同)乙腈溶液;等度洗脫,時間30 min;流量0.8 mL·min－1;進樣量10μL;熒光激發(fā)(λex)和發(fā)射波長(λem)分別為360,520 nm。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNS-Pi-NH2的合成

取DNS-CL 100 mg,在避光條件下溶于5 mL丙酮中,得到A 液。取碳酸鈉30 mg和N-(2-氨乙基)哌嗪300 mg,溶于3 mL水中,然后與10 mL乙腈混合,得到B液。將A 液緩緩滴入B 液中,避光攪拌30 min,得到C液。加入和C液等體積的乙酸乙酯進行萃取,搖勻后靜置分層。收集上層(乙酸乙酯層)液體,于78 ℃旋轉蒸發(fā)至溶液體積不大于1 mL。將得到的液體過C18固相萃取柱。洗脫液用紅外光譜、核磁共振碳譜(13C NMR)以及ESI-超高分辨飛行時間質譜(ESI-MS,質量數(shù)362.286 6)表征,所得物質即為DNS-Pi-NH2。

1.3.2 脂肪酸標準溶液的衍生化

取上述DNS-Pi-NH2和0.039 66 g TPP,分別用1.0 mL乙腈溶解制得DNS-Pi-NH2、TPP 溶液。取脂肪酸混合標準溶液、DNS-Pi-NH2溶液、DPDS和TPP溶液各175,10,25,25μL于1.5 mL塑料離心管中,室溫振蕩10 min,使衍生反應充分進行。待反應完成后,將產物轉移至10 mL 容量瓶中,用90%乙腈溶液稀釋至刻度,供FLD-HPLC分析。

1.3.3 樣品的測定

將含0.5 mol·L－1氫氧化鉀的乙醇溶液5 mL置于水浴燒杯中,加入2.0 mg小球藻脂肪酸甲酯樣品。連接回流冷凝管,于79 ℃加熱60 min,直至燒杯內溶液澄清透明,無明顯油珠,此時小球藻脂肪酸甲酯已被完全皂化。取下水浴燒杯,加入2～3滴酚酞指示劑,滴加0.5 mol·L－1鹽酸溶液至紅色消失。繼續(xù)于79 ℃水浴加熱30 min,使乙醇完全蒸發(fā)。所得固體用10 mL 水清洗,以轉速8 000 r·min－1離心5 min。再加入適量水于離心管中,振蕩5 min,產物用0.45μm 尼龍注射器過濾,以去除氯化鉀等雜質,烘干后,即得小球藻脂肪酸樣品。取1 mg小球藻脂肪酸樣品,按照1.3.2節(jié)試驗方法衍生和測定。

2 結果與討論

2.1 DNS-Pi-NH2 表征結果的分析

2.1.1 紅外光譜

所得紅外光譜圖見圖1。

圖1 紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum

參考文獻[18],分析圖1中官能團的紅外特征峰:3 363.4 cm－1處為N－H 的伸縮振動吸收峰,2 914.1,2 828.0 cm－1處為C－H 的伸縮振動吸收峰,1 455.3 cm－1處為CH2的變形振動吸收峰;1 665.3 cm－1處為芳環(huán)中C＝C 骨架伸縮振動吸收峰,說明合成的物質為芳香族化合物;1 572.8 cm－1處為N－H 的變形振動吸收峰,1 455.3 cm－1處為芳環(huán)C＝C 伸縮振動和CH3的C－H 不對稱變形振動的重合吸收峰,1 323.2 cm－1處為C－N(芳基碳)的伸縮振動吸收峰,1 143.5,1 067.5 cm－1處為C－N(烷基碳)的伸縮振動吸收峰,945.8 cm－1處為N(CH3)2的彎曲振動吸收峰。根據(jù)以上推斷,得出合成物質中含有苯環(huán)、N－H、C－N(芳基碳)、C－N(烷基碳)、CH2、CH3、N(CH3)2等官能團。

2.1.213C NMR

合成目標物的13C NMR 圖見圖2。

圖2 合成目標物和DNS-CL的13 C NMR 圖Fig.2 13 C NMR images of synthetic target and DNS-CL

結果表明:大于110×10－6的峰歸屬于DNSCL芳環(huán)中的碳;30×10－6～70×10－6的4個主峰歸屬于2-乙基氨基哌嗪中的碳;77×10－6處峰歸屬于溶劑氘代三氯甲烷中的碳。綜上可說明DNS-Pi-NH2已成功制備,推測其結構見圖3。

圖3 DNS-Pi-NH2 的結構Fig.3 Structure of DNS-Pi-NH2

2.1.3 ESI-MS

為了明確合成目標物(化學式M)的結構,對該物質進行ESI-MS分析,所得準分子離子[M＋H]＋的質量數(shù)為363.185 4,和DNS-Pi-NH2的理論值一致,說明DNS-Pi-NH2已正確合成。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

以1.0×10－6mol·L－1的十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸混合標準溶液為待測對象,考察了Eclipse XDB C8色譜柱和Hypersil ODS C18色譜柱對4種典型脂肪酸衍生物的分離效果的影響。結果顯示:以Hypersil ODS C18色譜柱分離時,十八烷酸和二十烷酸不能實現(xiàn)基線分離;Eclipse XDB C8色譜柱可實現(xiàn)4種目標物基線分離,且峰形較好。因此,試驗選擇以Eclipse XDB C8色譜柱分離各脂肪酸衍生物。

2.2.2 流動相乙腈溶液體積分數(shù)

試驗進一步考察了流動相乙腈溶液的體積分數(shù)分別為50%,90%時對以上4種脂肪酸衍生物分離效果的影響,結果見圖4。

圖4 不同體積分數(shù)乙腈溶液下4種脂肪酸衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of four fatty acid derivatives under different volume fractions of acetonitrile solution

由圖4可知:當乙腈溶液體積分數(shù)為50%時,可在色譜圖中明顯觀察到4 種脂肪酸衍生物,但4種脂肪酸衍生物色譜峰重疊嚴重,分離度差,未能得到基線分離;當乙腈溶液體積分數(shù)為90%時,30 min內可實現(xiàn)4 種脂肪酸衍生物的基線分離。因此,試驗選擇的流動相為90%乙腈溶液。

在上述優(yōu)化試驗條件下,1.0×10－6mol·L－1混合標準溶液的色譜圖見圖5。

由圖5可知,8種脂肪酸衍生物可在30 min內完成分離。

圖5 混合標準溶液的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the mixed standard solution

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

按照1.3.2 節(jié)試驗方法分析混合標準溶液系列,以各脂肪酸的濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,各脂肪酸標準曲線的線性范圍均為2.0×10－10～2.0×10－4mol·L－1,線性回歸方程、相關系數(shù)見表1。

按照1.3.2節(jié)試驗方法對1.0×10－10mol·L－1脂肪酸混合標準溶液重復分析11次,計算峰面積的標準偏差(s),以3s與標準曲線斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),所得結果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.3.2 精密度和回收試驗

用微藻培養(yǎng)液進行精密度和準確度試驗。向該微藻培養(yǎng)液中添加適量混合標準溶液,使加標量達到2.0×10－6mol·L－1,再重復測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,各脂肪酸的回收率為95.3%～102%,測定值的RSD為1.7%～2.6%。

2.4 樣品分析

按照試驗方法分析小球藻脂肪酸甲酯樣品,色譜圖見圖6。

由圖6可知,小球藻樣品中含有的脂肪酸依次為十六烷酸、順-9,12-十八(碳)烯酸、順-7,10,13-十六(碳)烯酸、順-9-十八(碳)烯酸,與文獻結果一致[19],4種脂肪酸檢出量分別為3.08,0.64,0.83,2.57 mg·g－1。

圖6 實際樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of the actual sample

本工作以自制DNS-Pi-NH2衍生化碳原子為10～20的脂肪酸,用FLD-HPLC 檢測。本方法衍生溫度低、反應時間短、樣品用量少、精密度和準確度較好,可為微藻中脂肪酸含量的測定提供一種簡便、快速、有效的分析方法。