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    兩種方法測定不同養(yǎng)殖模式下中華鱉鱉裙中膠原蛋白的含量

    2022-11-25 18:42:24宋光同方國俠朱成駿蔣業(yè)林
    理化檢驗-化學(xué)分冊 2022年5期
    關(guān)鍵詞:羥脯氨酸膠原蛋白水解

    王 芬,陳 祝,宋光同,方國俠,朱成駿,周 翔,蔣業(yè)林*

    (1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所,合肥 230031; 2.安徽省鱉類養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,蚌埠 233701;3.水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室,合肥 230031; 4.安徽杰與祥水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司,合肥 231221)

    中華鱉,俗稱甲魚、團魚,自20世紀90年代開始進行人工養(yǎng)殖,除西藏、青海、新疆外,其余各省均有養(yǎng)殖。養(yǎng)殖模式包括溫室養(yǎng)殖、池塘養(yǎng)殖、生態(tài)養(yǎng)殖(鱉植共作),其中溫室-外塘兩段式和鱉植共作為常見模式,鱉植共作模式有稻鱉共作、藕鱉共作、茭鱉共作等。人工養(yǎng)殖推動了中華鱉市場的蓬勃發(fā)展,其養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年上升。2019年的養(yǎng)殖產(chǎn)量約占當年全國淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖量的1%[1]。中華鱉是典型的低脂高蛋白食品,鱉裙中的粗蛋白質(zhì)量分數(shù)為20%~24%[2]。膠原蛋白具有抗氧化、提高抵抗力、促進傷口愈合以及美容等功效,已被廣泛用于生物材料、食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[3-4]。目前已知的膠原蛋白有29 種,其中種類最多的是Ⅰ型膠原蛋白[5]。文獻[6]發(fā)現(xiàn),鱉裙中的膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原蛋白。

    目前中華鱉的相關(guān)文獻主要集中在中華鱉營養(yǎng)成分以及風(fēng)味物質(zhì)的研究上[7-9],而關(guān)于不同養(yǎng)殖模式對鱉裙中膠原蛋白影響的研究較少[10]。為了科學(xué)指導(dǎo)中華鱉的養(yǎng)殖及消費,很有必要提供一種準確、快速測定中華鱉鱉裙中膠原蛋白含量的方法。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸,可用其含量計算膠原蛋白的含量[11]。該物質(zhì)的測定方法主要有紫外-可見分光光度法(UV-Vis)[3,11]、液相色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、氨基酸分析法[14]等。紫外-可見分光光度法儀器價格較低、操作方便、極易上手,但是分析精度相對較差;液相色譜法儀器較紫外-可見分光光度計價格高,分析精度也較高,但是需要一定的理論知識積累和操作熟練度;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法儀器價格最為昂貴,分析精度最高,對操作人員的要求也較高;氨基酸分析法是分析氨基酸種類和測定氨基酸含量較為精密的一種方法,對操作人員有一定的技術(shù)要求。鑒于此,本工作以溫室-外塘兩段式和藕鱉共作模式養(yǎng)殖的中華鱉為待測對象,采用操作要求較高,精密度最高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)和操作最為簡便的UV-Vis測定鱉裙中羥脯氨酸含量,以期為不同養(yǎng)殖模式對鱉裙中膠原蛋白影響的研究提供參考。

    1 試驗部分

    1.1 儀器與試劑

    島津LC-MS-8050型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀;島津UV-2550 型紫外-可見分光光度計;Millipore Milli-Q Integral型純水系統(tǒng)。

    標準儲備溶液:500 mg·L-1,取50 mgL-羥脯氨酸標準品,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中,搖勻備用。

    標準溶液系列1:取適量標準儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成1,2,5,10,20,50,100μg·L-1標準溶液系列,經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后供HPLC-MS/MS分析。

    標準溶液系列2:取適量標準儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成100,200,300,400,500 mg·L-1標準溶液系列,供UV-Vis分析。

    檸檬酸鹽緩沖液:pH 6.8,取26.0 g 檸檬酸、14.0 g氫氧化鈉和78.0 g無水乙酸鈉,用500 mL水溶解后轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中,加入250 mL 正丙醇,用水稀釋至刻度,即得pH 6.8檸檬酸鹽緩沖液。

    氯胺T 溶液:取1.41 g的氯胺T,用100 mL檸檬酸鹽緩沖液溶解即得,現(xiàn)用現(xiàn)配。

    顯色劑:取10.0 g對二甲氨基甲醛,用35 mL 60%(質(zhì)量分數(shù))高氯酸溶液溶解,然后緩慢加入65 mL異丙醇即得,現(xiàn)用現(xiàn)配。

    L-羥脯氨酸標準品的純度不小于98%;鹽酸、檸檬酸鈉、硫酸、氯胺T、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸和異丙醇等試劑均為分析純;試驗用水為純水。

    試驗所用藕鱉共作模式養(yǎng)殖的中華鱉(3 只,725 g±55 g)采自安徽省馬鞍山春盛生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司(馬鞍山),該中華鱉在出殼后,置于室外池塘中養(yǎng)殖至次年5~6月,再轉(zhuǎn)移至種植有蓮藕的外塘養(yǎng)殖3 a,其中蓮藕種植面積為30%~40%,中華鱉養(yǎng)殖密度為1.5只·m-2;所用溫室-外塘兩段式養(yǎng)殖的中華鱉(3只,600 g±60 g)采自安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(蚌埠),該中華鱉在出殼后,在水溫(30±0.5)℃溫室內(nèi)養(yǎng)殖至次年5~6月,再轉(zhuǎn)移至外塘進行標準化養(yǎng)殖2 a,養(yǎng)殖密度為2~3 只·m-2。

    1.2 儀器工作條件

    1.2.1 HPLC條件

    Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫35 ℃;進樣體積1μL;流量0.3 mL·min-1;運行時間5 min;流動相A 為0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0~0.01 min 時,B 為5%;0.01~0.50 min時,B 由5%升 至95%,保 持2.50 min;3.00~3.50 min 時,B 由95% 降 至5%,保 持1.50 min。

    1.2.2 MS/MS條件

    電噴霧離子源正離子(ESI+)模式;多反應(yīng)監(jiān)測模式;干燥氣為氮氣,流量10.0 L·min-1;加熱氣為空氣,流量10.0 L·min-1;碰撞氣為氬氣,壓力270 kPa;霧 化氣流 量3.0 L·min-1;接口溫度200 ℃;DL(脫溶劑管)溫度280 ℃;駐留時間150 ms;加熱模塊溫度300 ℃;延遲時間3 ms;接口電壓1.0 kV;L-羥脯氨酸母離子質(zhì)荷比(m/z)132.10;定量、定性離子m/z分別為86.2,68.3,駐留時間均為100 ms,Q1碰撞電壓分別為14,15 V,碰撞能量分別為22,14 eV,Q3碰撞電壓分別為27,30 V。

    1.3 試驗方法

    中華鱉經(jīng)斷頭宰殺后采集裙邊部分,用破壁機粉碎后裝入密封袋內(nèi),于-20 ℃冷凍備用。

    1.3.1 HPLC-MS/MS

    取鱉裙樣品約0.2 g,放入氨基酸專用水解管中,加入6 mol·L-1鹽酸溶液10.0 mL。將水解管放入冷凍劑(由食鹽與冰塊按質(zhì)量比1∶3混合而成)中冷凍5 min,抽真空并充入氮氣,密封后將水解管置于(110±2)℃恒溫箱中水解22~24 h。冷卻、混勻后開管,用濾紙將水解液過濾至50.0 mL容量瓶中,多次洗滌水解管,洗滌液也過濾至容量瓶中,用水稀釋至刻度,混勻。分取1.0 mL 樣品溶液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干,加入檸檬酸鈉-鹽酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 2.2)100.0 mL,混勻后以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液用0.22μm 濾膜過濾,濾液供HPLC-MS/MS分析。

    1.3.2 UV-Vis

    取鱉裙樣品約1 g于50 mL 具塞比色管中,加水10 mL和3 mol·L-1硫酸溶液30 mL,加蓋,置于恒溫干燥箱中,于105℃水解6 h。趁熱將水解產(chǎn)物用濾紙過濾至150 mL三角燒瓶中。分取10 mL于100 mL容量瓶中,用200 g·L-1氫氧化鈉溶液將溶液酸度調(diào)成中性,用水稀釋至刻度。分取4.0 mL待測液于25 mL 比色管中,加入氯胺T 溶液2.0 mL,混勻后于室溫放置20 min,加入顯色劑2.0 mL,充分混勻后,迅速將比色管放入60 ℃水浴中加熱20 min,再在冰水浴中冷卻3 min,最后在室溫下放置30 min,即可制得樣品溶液,將4.0 mL 待測液替換為4.0 mL 水,按照上述步驟制備空白溶液。以空白溶液為參比,在檢測波長558 nm 處測量樣品溶液的吸光度。

    1.3.3 數(shù)據(jù)處理

    以11.1(羥脯氨酸系數(shù))倍羥脯氨酸測定值計算膠原蛋白含量。采用軟件SPSS 22.0進行顯著性檢驗,當P≤0.05時表示存在顯著性差異。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 標準曲線和檢出限

    按照試驗方法分析標準溶液系列1和標準溶液系列2(以水作參比),以羥脯氨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應(yīng)的峰面積(HPLC-MS/MS)或吸光度(UV-Vis)為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示:兩種方法標準曲線線性范圍分別為1~100μg·L-1和100~500 mg·L-1,線性回歸方程分別為y=2.204×104x+6.665×103和y=3.400×10-4x-1.342×10-2,相關(guān)系數(shù)分別為0.999 4和0.998 9。

    用HPLC-MS/MS分析時,以3倍基線噪聲所得信號對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為羥脯氨酸的檢出限,所得結(jié)果為0.5μg·L-1;用UV-Vis分析時,以吸光度為0.01 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作檢出限,結(jié)果為63 mg·L-1[15]。

    2.2 精密度和回收試驗

    對實際樣品進行加標回收試驗,加標量分別為1.3 mg(HPLC-MS/MS)和2.5 mg(UV-Vis),每 種方法均做6個平行樣,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示,兩種方法的回收率分別為94.2%~99.3%和94.0%~98.0%,測定值的RSD 分別為2.2%和2.1%,說明兩種方法準確度和精密度均較好。

    2.3 樣品分析

    分別用HPLC-MS/MS和UV-Vis分析兩種養(yǎng)殖模式下所得的實際樣品。結(jié)果顯示:溫室-外塘兩段式養(yǎng)殖的中華鱉鱉裙中膠原蛋白的檢出量分別為(15.15±0.54)g/100 g和(14.76±0.27)g/100 g,顯著性差異試驗所得P值為0.075,說明兩種方法不存在顯著性差異;藕鱉共作模式養(yǎng)殖的中華鱉鱉裙中膠原蛋白的檢出量分別為(17.18±0.92)g/100 g和(17.96±0.10)g/100 g,測定值高于前一種養(yǎng)殖模式的,所得P值為0.011,說明兩種方法存在顯著性差異。推測主要是由檢測儀器的差異造成的,偏差均在合理的范圍內(nèi)。以上結(jié)果說明這兩種檢測方法都能夠?qū)δz原蛋白的含量進行有效地檢測。

    本工作采用UV-Vis和HPLC-MS/MS測定溫室-外塘兩段式和藕鱉共作模式養(yǎng)殖的中華鱉鱉裙中膠原蛋白的含量,兩種方法均能夠?qū)αu脯氨酸進行有效檢測。UV-Vis操作簡單、儀器價格低廉,可在常規(guī)實驗室廣泛推廣。UV-Vis樣品前處理步驟較多,需要制備空白樣[16],而HPLC-MS/MS 前處理相對簡單,能連續(xù)進樣、靈敏度和自動化程度高、可多種氨基酸同時分析,但是儀器價格昂貴、對技術(shù)人員要求較高,適用于條件較好的實驗室。在實際應(yīng)用時,可根據(jù)實驗室自身條件或者檢測需求選擇檢測方法。

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