妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥孕婦胎盤ABCB4基因表達(dá)與妊娠結(jié)局的關(guān)系

趙臨瀟，左博云，李靜亞，于東升

1.延安大學(xué)咸陽醫(yī)院病理科，陜西 咸陽 712000；

2.洛陽市婦幼保健院病理科，河南 洛陽 471000

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)多于妊娠末3個(gè)月發(fā)生，臨床主要表現(xiàn)為皮膚瘙癢、黃疸，孕婦血清膽汁酸水平明顯升高，與此同時(shí)血清膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶等也有輕度的增高，并在生產(chǎn)后癥狀迅速消失，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)恢復(fù)正常，再次妊娠后可復(fù)發(fā)[1-2]。ICP孕婦預(yù)后往往較好，但可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒窘迫等一系列胎兒新生兒不良后果，增加圍生兒疾病發(fā)生率和死亡率，被列為高危妊娠之一[3]。近年來，有研究認(rèn)為轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因ABCB4上的突變可能和ICP 的發(fā)生關(guān)系密切[4]。本研究分析ICP孕婦胎盤組織ABCB4基因表達(dá)水平變化，探討其與妊娠結(jié)局的關(guān)系，旨在為疾病的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2020年11月于延安大學(xué)咸陽醫(yī)院分娩的98 例ICP 孕婦納入ICP組，年齡21～39歲，平均(28.03±3.43)歲；孕次1～4次，平均(2.13±0.57)次；初產(chǎn)婦77例，經(jīng)產(chǎn)婦21例；發(fā)病時(shí)孕周≤34 周者19 例，＞34 周者79 例；按照血清總膽汁酸水平將＜40 mol/L 者納入輕度組(n=61)，將≥40 mol/L者納入重度組(n=37)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)ICP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)年齡≥20歲；(3)單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮先天畸形、胎位不正；(2)長(zhǎng)期生殖道用藥；(3)輔助生殖或促排卵受孕；(4)合并免疫或血液系統(tǒng)疾?。?5)合并高血壓、糖尿病、甲狀腺疾病、慢性腎炎等；(6)合并嚴(yán)重心、腎、肺等臟器疾?。?7)臨床資料不全。另選取健康孕婦50例納入對(duì)照組，年齡22～39 歲，平均(28.19±3.29)歲；孕次1～4 次，平均(1.84±0.29)次。ICP組與對(duì)照組孕婦的年齡、孕次比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦及家屬知情同意。

1.2 方法 娩出胎盤15 min內(nèi)采集標(biāo)本，取母體面中央位置，去掉底部的蛻膜層，取約1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盤組織塊，注意避開異常組織(例如梗死區(qū)、鈣化灶、出血處)，10%甲醛固定，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(RT-PCR)法測(cè)定ABCB4 mRNA 表達(dá)水平，以免疫組化法測(cè)定ABCB4蛋白表達(dá)水平。

1.2.1 ABCB4 mRNA 檢測(cè) 通過RT-PCR 法，生理鹽水洗滌冷凍胎盤組織至無血色，剪碎置于勻漿器，提取總RNA。取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA合成，使用美國(guó)7300 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)。內(nèi)參β-actin 引物 序 列：上 游 引 物5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物5′-TCA GGAGGAGCAATGAT CTTG-3′；ABCB4 引物序列：上游引物5′-CTGCTGGAAAGATTGCAACAG-3′，下游引物5′-GAGCAAAT GAACTCGCATGTC-3′。反應(yīng)體系及條件：10×PCR緩沖液2.5 μL，d NTP 混合物0.5 μL，10×PCR 緩沖液0.5 μL，上下游引物各0.5 μL；95℃孵育30 s后開啟循環(huán)：95℃變性(15 s)、60℃退火(20 s)、70℃延伸(10 s)，共40 個(gè)循環(huán)。測(cè)定ABCB4 mRNA 灰度，以β-actin 灰度值作為對(duì)照，獲得相對(duì)量。

1.2.2 ABCB4 蛋白檢測(cè) 標(biāo)本4 μm 厚連續(xù)切片，脫蠟，梯度酒精脫水，0.01 mol/L 檸檬酸鈉抗原修復(fù)，室溫下3%過氧化氫(H2O2)阻斷10 min，磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)清洗(3 次) 10%的牛血清白蛋白(BSA)浸潤(rùn)，室溫下孵育5 min，封閉非特異性位點(diǎn)，加一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗(3次)。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記P 物質(zhì)(SP)，37℃孵育，時(shí)長(zhǎng)為30 min，PBS清洗3 次，DAB顯色10 min，PBS 清洗(3 次)，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化后脫水10 min，封片后于鏡下觀察。隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，以陽性比例與染色強(qiáng)度判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，采用多因素Logistic 回歸分析ICP 孕婦妊娠結(jié)局不良的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICP 組與對(duì)照組胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4 蛋白表達(dá)水平比較 ICP 組胎盤組織中ABCB4 mRNA 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，ABCB4 蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1和圖1。

圖1 免疫組化法檢測(cè)ABCB4蛋白在胎盤組織中的表達(dá)(×400)

表1 ICP組與對(duì)照組胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4 蛋白表達(dá)水平比較

2.2 輕度與重度孕婦胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4 蛋白表達(dá)水平比較 重度組孕婦胎盤組織中ABCB4 mRNA 表達(dá)水平明顯低于輕度組，ABCB4蛋白陽性表達(dá)率明顯低于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 輕度與重度ICP孕婦胎盤組織中ABCB4 mRNA與ABCB4蛋白表達(dá)差水平比較

2.3 ICP 組與對(duì)照組孕婦的不良妊娠結(jié)局比較 ICP 組孕婦的羊水污染、胎兒窘迫、早產(chǎn)、新生兒窒息、圍生兒死亡發(fā)生率明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 ICP組與對(duì)照組孕婦的不良妊娠結(jié)局比較[例(%)]

2.4 影響ICP孕婦妊娠結(jié)局的因素 ICP組孕婦中共有46 例出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局，發(fā)生率為46.94%。不同孕次、產(chǎn)次ICP孕婦不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；年齡≥35歲、發(fā)病孕周≤34周、疾病程度為重度、ABCB4 蛋白陰性表達(dá)、ABCB4 mRNA低表達(dá)ICP孕婦不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高于年齡＜35 歲、發(fā)病孕周＞34 周、疾病程度為輕度、ABCB4蛋白陽性表達(dá)、ABCB4 mRNA 高表達(dá)ICP 孕婦,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 影響ICP組妊娠結(jié)局的單因素分析[例(%)]

2.5 ICP 孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 將上述因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)納入多因素Logistic 回歸模型，以妊娠結(jié)局作為因變量，以上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)作為自變量，并進(jìn)行賦值：年齡(＜35歲=0，≥35 歲=1)、發(fā)病孕周(＞34 周=0，≤34 周=1)、疾病程度(輕度=0，重度=1)、ABCB4 蛋白表達(dá)(陽性=0、陰性=1)、ABCB4 mRNA 表達(dá)(高表達(dá)=0，低表達(dá)=1)。經(jīng)多因素Logisitic回歸分析結(jié)果顯示，高齡、發(fā)病孕周≤34 周、疾病程度高、ABCB4 蛋白陰性表達(dá)、ABCB4 mRNA低表達(dá)是ICP孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見表5。

表5 ICP組孕婦不良妊娠結(jié)局多因素Logistic回歸分析

3 討論

臨床上ICP發(fā)病率為0.2%～20%，且疾病的發(fā)生具有明顯種族與地域差異，病因較為復(fù)雜，多數(shù)研究認(rèn)為，ICP是多因素綜合作用下產(chǎn)生的結(jié)果，基因遺傳易感性決定了個(gè)體肝臟對(duì)雌激素代謝敏感性[6-7]。

近年來，隨著對(duì)遺傳和分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，肝臟存在膽淤相關(guān)基因，如ABCB4 基因、BSEP 基因、FIC1 基因等，均參與肝臟膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌載體等的編碼[8]。結(jié)構(gòu)與功能方面，胎盤和肝臟具有一定的相似性，相關(guān)研究也表明絨毛和胎盤上均有膽淤相關(guān)基因的表達(dá)[9]。作為妊娠期特殊器官，胎盤在胎兒物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中具有關(guān)鍵性作用，其中包括了膽汁酸的排泌，通常情況下，部分膽汁酸經(jīng)胎兒腎臟排泄至羊水外，另外大部分膽汁酸則通過胎盤組織屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到母體血液循環(huán)中[10]。ABCB4 基因編碼的ABCB4 蛋白屬于P-糖蛋白超基因家族，主要于肝毛細(xì)膽管膜分布[11]。ELSEMIEKE 等[12]研究表明人體ABCB4基因突變可使DMR3蛋白缺乏，膽汁磷脂的分泌減少，導(dǎo)致膽管細(xì)胞凋亡或壞死，誘發(fā)膽汁淤積。

本研究中ICP 組孕婦ABCB4 mRNA 表達(dá)及ABCB4 蛋白陽性率低于對(duì)照組，且疾病嚴(yán)重程度高的患者相較于輕度患者ABCB4 mRNA 表達(dá)水平及ABCB4 蛋白陽性表達(dá)率更低，表明ICP 孕婦胎盤ABCB4基因表達(dá)水平相較于正常孕婦明顯降低，且其表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，WEI 等[13]研究結(jié)果支持本研究結(jié)論。ABCB4 是肝臟毛細(xì)膽管膜磷脂輸出泵，可將磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至毛細(xì)膽管并與毛細(xì)膽管內(nèi)的膽鹽形成微膠粒，使膽管細(xì)胞免受膽鹽損傷，ABCB4 基因低表達(dá)可能導(dǎo)致膽管損傷，從而引起膽汁淤積[14]。相關(guān)研究表明ICP 對(duì)胎兒健康危害性極大，大大增加了不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究中ICP 組羊水污染、胎兒窘迫、早產(chǎn)、新生兒窒息、圍生兒死亡發(fā)生率均高于對(duì)照組，ICP孕婦高膽汁酸使得子宮肌收縮力增加，促進(jìn)子宮收縮，導(dǎo)致早產(chǎn)發(fā)生；高膽汁酸具有毒性作用，可損傷細(xì)胞膜、線粒體膜等，生成氧自由基造成呼吸鏈功能的異常，造成胎兒急性缺氧；膽汁酸可促進(jìn)胎兒結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，促使胎便排出，導(dǎo)致羊水污染，增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步分析ABCB4 基因表達(dá)水平與臨床ICP孕婦不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，Logistic回歸分析結(jié)果顯示ABCB4 蛋白陰性表達(dá)、ABCB4 mRNA低表達(dá)是ICP孕婦不良妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ABCB4 表達(dá)下降，DMR3蛋白功能、定位、降解異常，胎盤膽汁酸排泌速度受阻、效率下降，最終使ICP孕婦胎兒因血清膽汁酸明顯升高而加大不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，ICP孕婦胎盤組織ABCB4基因呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，胎盤組織ABCB4 基因表達(dá)水平與妊娠結(jié)局關(guān)系密切，ABCB4 基因表達(dá)水平下降可增加不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)。