LncRNA MEG3在前列腺癌中的表達及其分子調(diào)控網(wǎng)絡研究

曹石金，羅錦斌，何海填，張新明，葉宗岳，曾燦，王可兵

深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518067

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一類嚴重威脅男性生命健康的惡性腫瘤。據(jù)美國癌癥學會統(tǒng)計：2016年PCa 新發(fā)病占男性惡性腫瘤新發(fā)病例的21%，位列男性惡性腫瘤第1 位；死亡病例占惡性腫瘤死亡病例總數(shù)的8%，排名全球第2 位[1]。母系表達基因3(maternally expressed gene3，MEG3)是一段長度約1.6 kb的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，定位于人類染色體14q32.3中的印記基因[2]。已有較多文獻報道MEG3是抑癌基因，在多種癌組織中發(fā)現(xiàn)其表達缺失[3]。MEG3 作為一個經(jīng)典的抑癌基因[4]，既可作為PCa診斷的生物標志物，又能調(diào)控PCa的進程，然而目前MEG3調(diào)控PCa的分子生物學機制仍知之甚少。本文首先用實驗明確了MEG3 在PCa 組織中的表達情況，再用生物信息學方法預測MEG上游轉(zhuǎn)錄因子、下游靶miRNA 及靶miRNA 的靶基因，并繪制了其整個分子調(diào)控網(wǎng)絡，為進一步研究MEG3 在PCa 發(fā)生中的分子生物學機制提供了新線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年7 月至2020 年5 月深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院收治的20 例PCa 患者行前列腺穿刺活檢術及根治術獲取的樣本作為Tumor組，20例經(jīng)尿道前列腺剜除術的良性前列腺增生組織標本作為Normal 組。Tumor 組患者平均年齡(69.87±3.66)歲，平均病程(9.06±1.18)年。Normal組患者平均年齡(70.06±4.13)歲，平均病程(9.31±2.01)年。兩組患者的年齡和病程比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過。

1.2 實時熒光定量檢測聚合酶鏈反應(PCR) 采用預冷的TRIzol(Invitrogen)提取樣本組織中總RNA，檢測合格后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Power SYBR Green(TaKaRa)試劑盒說明書進行操作后，將20 μL反應體系PCR反應體系按以下條件進行反應：95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)。MEG3上游引物：5′-CTGCCCATCTACAC CTCACG-3′；下 游 引 物：5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′。內(nèi)參基因選GAPDH 上游引物：5′-TGCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′；下 游 引 物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。上機檢測后，按2-△△Ct法計算MEG3基因相對表達量。

1.3 生物信息學預測 在UCSC 數(shù)據(jù)庫(http：//genome.ucsc.edu)查詢MEG3 在人類基因組中的定位及其保守性。用PROMO 數(shù)據(jù)庫(http：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？ dirDB=TF_8.3)預測MEG3 啟動子序列的轉(zhuǎn)錄因子。用DIANA生物學軟件(http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php? r=site/index )預測MEG3 下游靶miRNA。用miRTarBase 軟 件(http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/search.php)在線預測MEG3 下游靶miRNA的靶基因，并繪制MEG3與PCa 發(fā)生有關的分子調(diào)控網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 兩組患者的MEG3基因表達水平比較 Tumor組患者的MEG3 表達水平為2.64±0.305，明顯低于Normal 組的8.23±0.759，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 兩組MEG3基因表達水平比較

2.2 MEG3在人類基因組中的定位及保守性 運用UCSC 基因組工具[Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly] 明確MEG3 在人類基因組中的定位。MEG3 定位于人類14q32.3 染色體的100826118～100861026之間，見圖2。MEG3的轉(zhuǎn)錄起始位點具有較高的保守性，見圖3。

圖2 UCSC基因組工具分析MEG3在人類基因組中的定位

圖3 UCSC基因組工具分析MEG3在人類基因組中的保守性

2.3 MEG3 與上游序列結合的轉(zhuǎn)錄因子 首先運用UCSC 數(shù)據(jù)庫得到MEG3 啟動子序列后，在PROMO 數(shù)據(jù)庫中，將容錯率設置為0%的情況下預測MEG3啟動子序列，共有18個轉(zhuǎn)錄因子，包括YY1、C/EBPβ、GR-α等，見圖4。

圖4 MEG3啟動子序列上的轉(zhuǎn)錄因子

2.4 MEG3與miRNA 運用DIANA生物學軟件進行預測，Threshold 調(diào)為0.8，結果可得到與MEG3 結合的miRNA 共有32 個。通過檢索文獻報道，結合評分大于0.9 以上，且在腫瘤研究中相對廣泛的hsa-miR-877-3p進一步分析。

2.5 miR-877-3p 與靶基因 運用miRTarBase軟件在線預測hsa-miR-877-3p 靶基因，統(tǒng)計Pred.Score≥0.800 分的基因共有40 個。選取與PCa 相關的3 個基因包括小泛素相關蛋白1(small ubiquitin related modifier 1，SUMO1)、富亮氨酸纖維連接蛋白跨膜2(fibronectin leucine rich transmemrane 2，F(xiàn)LRT2)、人類免疫缺陷病毒I 型增強子結合蛋白3(human immunodeficiency virus type I enhancer binding proteins，HIVEP3)等。

2.6 繪制MEG3 在PCa表達的分子調(diào)控網(wǎng)格經(jīng)總結分析，對MEG3在PCa的分子調(diào)控網(wǎng)絡進行繪制，如圖5所示。

圖5 MEG3參與PCa發(fā)病的分子調(diào)控網(wǎng)絡

3 討論

PCa 是泌尿外科臨床上常見的惡性腫瘤之一，隨著我國平均壽命的延長，其臨床發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢[5]。早期PCa 患者經(jīng)過綜合治療后，預后通常良好[6]，然而目前仍有相當一部分PCa 患者在確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，預后較差。雖然內(nèi)分泌治療可以在一定程度上控制和改善多數(shù)中晚期PCa 患者的病情，但其中絕大多數(shù)患者仍會進展為預后極差的去勢抵抗性PCa[7-8]。因此，深入探尋PCa 發(fā)生發(fā)展的分子通路及相關基因異常，闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展機制，尋找其轉(zhuǎn)移及耐藥的分子機制及有效靶點，對于提高PCa的早期診斷效率、發(fā)掘新的治療靶點與預后判斷方法具有重要意義。

生物信息學(bioinformatics)是在人類基因組計劃下快速興起的一門新興交叉學科，主要涉及計算機、生物學和數(shù)學等多門學科的綜合技術應用[9]。隨著基因測序技術及數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展，臨床研究采用生物信息學深度挖掘與人類疾病有關的測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)新的分子信號通路已成為可能。并且該法具有經(jīng)費投入少、樣本量大和能優(yōu)化處理大量數(shù)據(jù)等優(yōu)點，為初步篩選有價值的分子標志物和繼續(xù)深度研究提供了新線索[10]。利用生物信息學軟件分析相應基因，從而提升研究方案的科學性和邏輯性，從而進一步使具體的深度研究更有針對性和目標性，能大幅度節(jié)約試驗的工作量。LncRNA是一種轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，其參與了機體免疫調(diào)控、X 染色體沉默、染色質(zhì)修飾和轉(zhuǎn)錄干擾等調(diào)控過程，可在表觀遺傳學水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多種層面上調(diào)控基因的表達[11-12]。目前，越來越多的lncRNA 被鑒定和研究，而在眾多l(xiāng)ncRNA 中，MEG3 的研究比較深入，其被發(fā)現(xiàn)在許多癌癥如肝癌、白血病和腦癌等中表達缺失[13]。

本研究首先分析了MEG3在PCa組織和良性前列腺增生組織的基因表達差異，結果顯示MEG3 在Tumor 組中的表達明顯低于Normal 組，揭示了MEG3 在PCa 中也存在表達缺失的情況。為了進一步了解MEG3 在PCa 的分子生物學機制，本文進一步采用生物信息學方法預測及繪制MEG3在PCa的分子調(diào)控網(wǎng)絡。本研究用UCSC基因組工具明確MEG3在人類基因組中的定位，MEG3 定位于人類14q32.3 染色體的100 826 118～100 861 026 之間；確定了MEG3 的轉(zhuǎn)錄起始位點具有較高的保守性；用PROMO 數(shù)據(jù)庫預測MEG3 啟動子序列一共有18 個轉(zhuǎn)錄因子，包括YY1、C/EBPβ、GR-α等；用DIANA 生物學軟件進行預測得到與MEG3 結合的miRNA 共有32 個，且結合文獻報道，篩選評分大于0.9以上，選在腫瘤研究中相對廣泛的hsa-miR-877-3p進一步分析。已有研究表明，在乳腺癌中miR-877-3p 表達缺失，而人類表皮生長因子受體2(HER-2)則過表達，在進一步機制研究中發(fā)現(xiàn)，miR-877-3p mimic能降低細胞增殖、侵襲等生物學功能，這揭示了miR-877-3p 在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[14]。另外，在膀胱癌細胞中miR-877-3p和p16 基因均表達缺失，過表達miR-877-3p 能有效抑制膀胱癌細胞的增殖、平板克隆和皮下成瘤能力，其抑癌作用可能與特異性激活p16 基因表達有關[15]。為了進一步了解hsa-miR-877-3p 調(diào)控的靶基因，作者采用miRTarBase 軟件在線預測其靶基因，統(tǒng)計Pred.Score≥0.800 分的基因共有40 個，選取與PCa 相關的3 個基因包括SUMO1、FLRT2、HIVEP3 等，最后對MEG3 在PCa 中的分子調(diào)控網(wǎng)絡進行了繪制。SUMO 參與了SUMO化的修飾過程，其蛋白分子量約為12 kD。SUMO 化修飾是一種蛋白翻譯后的修飾，在調(diào)節(jié)幾乎所有細胞功能方面發(fā)揮重要的作用[16]。SUMO化修飾失調(diào)可能參與了人類疾病，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等[17]。我國研究者發(fā)現(xiàn)壯觀霉素B1和四逆湯均能通過下調(diào)人非小細胞肺癌A549中SUMO1 和p-Akt 表達，和上調(diào)PETN 和Caspase-9 表達，從而降低細胞的增殖、侵襲和遷移力[18]。國外有研究者發(fā)現(xiàn)通過去SUMO 化修飾能誘導HIF1α依賴型的血管生成及提高PCa 細胞的增殖力[19]。FLRT 家族首次由Lacy 在1999 年在細胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，其家族成員包括FLRT1、FLRT2 和FLRT3。FLRT 家族成員主要通過參與細胞分選、黏附、縮聚，以及對成纖維細胞生長因子信號及其受體的共同作用而在脊椎動物的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[20]。近來有國外研究者為了開發(fā)新的手段用來區(qū)分惰性PCa 和侵襲性PCa，利用了綜合高通量陣列相對甲基化分析整個基因組差異甲基化區(qū)域(differentially methylated regions，DMRs)，包括基于Gleason 分級的PCa 患者CpG島(CGI)和非CGI 區(qū)域，結果發(fā)現(xiàn)Gleason 等級低vs高比較中排名前5 的候選DMRs 中，就包括了OPCML、ELAVL2、EXT1、IRX5和FLRT2，這揭示了FLRT2異常表達與PCa 密切相關[21]。HIVEP3，也被稱為KBP-1、KBP1、KRC、SHN3、Schnurri-3、ZAS3 和ZNF40C，是HIVEP 家族成員之一。據(jù)研究表明，HIVEP3 在免疫球蛋白基因重排、細胞存活、巨噬細胞中腫瘤壞死因子信號轉(zhuǎn)導、輔助T 淋巴細胞中IL-2 基因表達、成骨細胞骨形成、腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[22]。近來我國有研究者通過采用RNA 干擾在PCa 細胞系中敲除SOX9表達，并在體外分析SOX9 抑制對HIVEP3表達的影響，并用定量PCR 和免疫組化方法檢測了人類PCa 組織中HIVEP3 和SOX9 的表達模式，結果發(fā)現(xiàn)SOX9 過表達會激活HIVEP9 表達，這可能是PCa 患者預后不良的重要因素，并提示聯(lián)合分析HIVEP9 和SOX9 表達情況有助于預測PCa 患者的腫瘤進展和預后情況[23]。然而，這一系列推導出的MEG3 在PCa 的分子調(diào)控通路仍需進一步采用實驗進行驗證。

綜上所述，本文證實了MEG3 在PCa 中存在表達缺失的情況。采用生物信息學方法預測分析顯示與PCa 相關且可能與MEG3 結合的轉(zhuǎn)錄因子(YY1、XBP-1 和FOXP3 等)、miR-877-3p 和miR-877-3p 靶基因(SUMO1、FLRT2 和HIVEP3)相互關聯(lián)，并構成以MEG3 為核心的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡，為進一步研究MEG3 在PCa 發(fā)生中的分子生物學機制提供了新線索。