文拉法辛聯(lián)合長春西汀在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究

麥麥提艾力·色依提 孫鈺淑 孫玲 李文芳 劉茜

關(guān)鍵詞文拉法辛;長春西汀;藥代動力學;藥物相互作用;代謝;大鼠

抑郁癥是一種由生理、心理以及社會環(huán)境因素等導致的臨床常見復雜疾病。抑郁癥患者情緒低落、悲觀，生理上表現(xiàn)為思維遲緩、失眠、軀體不適，當抑郁癥發(fā)展到嚴重階段，甚至會產(chǎn)生自殘自殺行為[1]。抑郁癥難以治愈，復發(fā)率高，29%～66%的抑郁癥患者使用單一抗抑郁藥物進行治療時不能完全恢復[2-4]。

文拉法辛（venlafaxine，VEN）為第2 代非三環(huán)苯乙胺類抗抑郁藥，通過阻滯突觸前膜的5-羥色胺、去甲腎上腺素以及部分多巴胺重攝取從而治療抑郁癥[5]。VEN口服吸收速度快，不良反應小，是治療抑郁癥尤其是難治性抑郁癥的首選藥物之一[6-7]。VEN體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物是N-去甲文拉法辛（N-desmethylvenlafaxine，NDV）和O-去甲文拉法辛（O-desmethylvenlafaxine，ODV），其中ODV 由VEN 通過細胞色素P450（CYP450）酶CYP2D6（89%）、CYP2C19（10%）和CYP2C9（1%）代謝生成，具有抗抑郁活性，且作用效果與VEN類似[8]。歐洲精神病藥理學會與神經(jīng)精神藥理學會發(fā)布的治療藥物監(jiān)測指南中推薦對VEN及ODV的血藥濃度進行監(jiān)測[9]。

長春西?。╲inpocetine，VIN）可抑制鈣離子依賴性磷酸二酯酶的活性，增加環(huán)磷酸腺苷的含量，松弛血管平滑肌，增加腦灌注量，常用于治療心血管疾病及抑郁癥[10]。VIN體內(nèi)吸收快速，約75%被迅速水解為活性代謝物阿樸長春胺酸（apovincaminic acid，AVA），致使VIN在血漿中的濃度較低。VIN 和AVA藥理活性具有顯著的相關(guān)性，檢測AVA 即可反映VIN 的藥代動力學行為[11-12]，因此本研究只測定AVA的血藥濃度。

患者抑郁癥發(fā)作時，進行VEN聯(lián)合VIN 治療，可明顯降低其漢密爾頓焦慮量表評分，且療效較單用VEN明顯提高[13-14]。VEN代謝過程中涉及多種CYP450同工酶，而VIN對其中CYP3A4、CYP2D6 均有一定抑制作用，從而影響VEN 的代謝[15-16]?；诖耍狙芯坎捎靡合嗌V- 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定大鼠血漿中VEN、ODV、AVA 的濃度，進而研究VIN 聯(lián)用VEN 的藥代動力學，考察兩者的相互作用，以期為兩者合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）、API2000 型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國ABSciex 公司）、管式加熱L-119A型氮吹儀[來亨科技（北京）有限公司]、DW-86W100 型臥式超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）、BS 124S 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、LG10-2.4A型高速離心機（北京雷勃爾離心機有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑本研究所用主要藥品與試劑有VIN對照品（廣東健坤藥業(yè)有限公司，含量100.2%，批號151221-41815003），VEN、ODV對照品（上海麥克林生化科技有限公司，含量均大于99.5%，批號分別為M00118009、C10034477），AVA對照品（國家標準物質(zhì)資源平臺，含量99.5%，批號101439-201901），多潘立酮對照品（信陽市中檢計量生物科技有限公司，含量99.8%，批號100304-201103）;甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，甲基叔丁基醚、無水碳酸鈉為分析純，其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物本研究所用動物為SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，購自沈陽藥科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2019-0058。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件（1）色譜條件一（檢測VEN、ODV）：

色譜柱為Agilent TC-C1（8 150 mm×4.6 mm，5 μm），保護柱為Agilent-C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液（50 ∶ 45 ∶ 5，V/V/V）;流速為800μL/min;柱溫為40 ℃。（2）色譜條件二（檢測AVA）：色譜柱為Agilent TC-C1（8 150 mm×4.6 mm，5 μm），保護柱為Agilent-C18（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲醇-乙腈溶液（85 ∶15，V/V）;流速為800 μL/min;柱溫為40 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，正離子檢測，多反應監(jiān)測掃描;離子源溫度為450 ℃，離子源噴射電壓為5.5 kV;氣簾氣壓力為20 psi;噴霧氣、輔助加熱氣壓力均為70 psi;碰撞氣體壓力為7 psi;VEN、ODV、AVA及多潘立酮（內(nèi)標）的去簇電壓分別為22、23、100、55eV，碰撞能量分別為30、34、33、37.2 eV;定量分析離子對分別為m/z 278.1→m/z 121.0（VEN）、m/z 264.1→m/z107.0（ODV）、m/z 323.2→m/z 236.1（AVA）、m/z 426.1→m/z 175.1（內(nèi)標）。VEN、ODV、AVA和多潘立酮的全掃描質(zhì)譜圖及化學結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2 標準溶液的配制精密稱定VEN、ODV、AVA對照品各10 mg，分別置于100 mL 量瓶中，以甲醇溶解定容，即得VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的儲備液。取上述各成分儲備液適量，分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度均為5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列標準溶液。同法制備VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度均分別為10、100、4 000ng/mL的質(zhì)控（QC）工作溶液。

2.3 標準血漿樣品與QC樣品的配制取VEN、ODV、AVA相同質(zhì)量濃度的系列標準溶液各50 μL 于同一5 mL離心管中，共8 份，加入500 μL 空白血漿，配制成VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度均分別為0.5、1、5、10、50、100、200、500 ng/mL 的標準血漿樣品，備用。另取VEN、ODV、AVA的QC工作溶液各50 μL，加入500 μL 空白血漿，渦旋1 min，制備VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度均分別為1、10、400 ng/mL的QC樣品，備用。

2.4 血漿樣品的預處理方法2.4.1 VEN及ODV血漿樣品的預處理取100 μL大鼠血漿，加入200 ng/mL 內(nèi)標溶液10 μL，渦旋1 min;加入0.1 mol/L 碳酸鈉溶液100 μL，渦旋1 min，再加入甲基叔丁基醚3 mL，渦旋震蕩20 min;以12 000 r/min 離心10min，取上清液，置于另一離心管，以37 ℃氮氣吹干，殘渣加100 μL 甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液復溶，取20 μL 進行LC-MS/MS分析。

2.4.2 AVA血漿樣品的預處理取100 μL大鼠血漿，加入200 ng/mL 內(nèi)標溶液10 μL，渦旋30 s;加入1 mol/L 鹽酸100 μL，渦旋30 s，再加入乙酸乙酯3 mL，渦旋1 min;以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，置于另一離心管，以37 ℃氮氣吹干，殘渣加100 μL 甲醇-乙腈溶液復溶，取20 μL進行LC-MS/MS分析。

2.5 方法學考察2.5.1 專屬性考察取大鼠空白血漿100 μL，除用10μL甲醇替代內(nèi)標外，其余操作同“2.4”項下2 種血漿樣品的預處理方法分別處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析。按“2.3”項下方法操作，配制VEN、ODV、AVA、內(nèi)標質(zhì)量濃度分別為0.5、0.5、0.5、200 ng/mL 的標準血漿樣品，再按上述方法處理后進樣分析。取“2.6”項下給藥0.25 h 后單只大鼠血漿樣品，再按上述方法處理后進樣分析。結(jié)果顯示，VEN、ODV、內(nèi)標的保留時間分別為1.85、1.85、1.86 min，AVA、內(nèi)標的保留時間分別為3.12、2.94 min（均以標準血漿樣品計），表明該法血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標分析物。結(jié)果見圖2、圖3。

2.5.2 線性關(guān)系與定量下限考察取“2.3”項下配制的標準血漿樣品，按“2.4”項下2 種血漿樣品預處理方法操作，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄圖譜。以VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度為橫坐標（X），VEN、ODV、AVA分別與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標（Y），采用加權(quán)最小二乘法[17]進行線性回歸。結(jié)果顯示，VEN、ODV、AVA的回歸方程分別為Y=9.98×10-2X-0.061 2×10-2 （r=0.999 8）、Y=9.86×10-2X+3.81×10-2（r=0.998 1）、Y=9.17×10-2X+3.27×10-3（r=0.995 7），線性范圍均為0.5～500 ng/mL，定量下限均為0.5 ng/mL。

2.5.3 準確度與精密度考察按“2.3”項下操作，配制0.5 ng/mL 的VEN、ODV、AVA定量下限樣品，取“2.3”項下質(zhì)量濃度分別為1、10、400 ng/mL 的QC樣品適量，按“2.4”項下方法操作，各質(zhì)量濃度平行分析6 樣本，連續(xù)3個分析批。根據(jù)所建標準曲線，得各樣品的實測質(zhì)量濃度，并考察日內(nèi)、日間精密度[以相對標準偏差（RSD）表示]和準確度[以相對誤差（RE）表示]，結(jié)果見表1。

2.5.4 穩(wěn)定性考察取VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度均為1、400 ng/mL 的QC樣品，按“2.4”項下方法操作，各質(zhì)量濃度平行分析3 樣本，分別考察血漿樣品處理前室溫放置2 h 和處理后室溫放置0、4、8 h 的穩(wěn)定性，自動進樣器放置穩(wěn)定性，3 次冷凍-解凍循環(huán)穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性（-70 ℃保存30 d）。結(jié)果顯示，VEN、ODV、AVA的不同QC樣品在上述條件下，實測質(zhì)量濃度的RSD 均小于14%（n=3），穩(wěn)定性良好。

2.5.5 提取回收率考察取“2.3”項下VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度均為1、10、400 ng/mL 的QC樣品，按“2.4”項下方法操作，各質(zhì)量濃度平行分析6 樣本，得峰面積均值A(chǔ)。取VEN、ODV、AVA 質(zhì)量濃度均為10、100、4 000ng/mL的QC工作液各10 μL于不同離心管中，以氮氣吹干;另取大鼠空白血漿100 μL，除用10 μL甲醇替代內(nèi)標外，其余按“2.4”項下方法操作，然后將上清液移至上述氮氣吹干的離心管中，渦旋使之充分溶解，再以氮氣吹干，加100 μL 甲醇復溶后進樣分析，各質(zhì)量濃度平行分析6 樣本，得峰面積均值B。內(nèi)標同法操作。按公式計算提取回收率（提取回收率=A/B×100%），結(jié)果見表2。2.5.6 基質(zhì)效應考察取VEN、ODV、AVA質(zhì)量濃度分別為1、400 ng/mL 的QC樣品各10 μL 和內(nèi)標10 μL，以氮氣吹干;取大鼠空白血漿100 μL，除不加內(nèi)標外，其余按“2.4”項下方法操作至取上清液，轉(zhuǎn)移上清液至上述氮氣吹干的離心管中，渦旋使之充分溶解，再以氮氣吹干，加流動相100 μL復溶，取20 μL進樣分析，各質(zhì)量濃度平行分析6 樣本，得到峰面積均值A(chǔ)1。另外，除用水代替大鼠空白血漿外，其余處理同上，得到峰面積B1。以A1/B1計算得VEN、ODV、AVA和內(nèi)標的基質(zhì)因子，利用各成分和內(nèi)標的基質(zhì)因子計算經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子。

結(jié)果顯示，VEN、ODV、AVA的1 ng/mL QC 樣品的基質(zhì)因子變異系數(shù)分別為0.93%、0.98%、1.00%，400 ng/mLQC 樣品的基質(zhì)因子變異系數(shù)分別為1.01%、0.96%、0.90%，符合生物樣品測定要求。

2.6 藥代動力學實驗將18 只健康雄性SD 大鼠，隨機分為VEN 組（13.5mg/kg）、VIN 組（1.8 mg/kg）和VEN+VIN 組（13.5 mg/kgVEN+1.8 mg/kg VIN），每組6 只，給藥劑量參考文獻[14]設置。給藥前，各組大鼠禁食不禁水12 h，一次性灌胃給予相應藥物。VIN 組于給藥前（0 h）和給藥后0.333、0.583、0.75、1、1.25、2、4、6、8、12、24、36 h 采血;VEN組于給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.333、0.583、0.75、1、1.25、2、4、8、12 h 采血;VIN+VEN組于給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.333、0.583、0.75、1、1.25、2、4、6、8、12、24、36 h 采血。每只大鼠均從眼眶靜脈叢采血約0.5 mL，并置于肝素處理過的離心管中。各組采集的血漿樣品以4 000r/min 離心10 min，取上清液，按“2.4”項下方法處理，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，代入當日建立的標準曲線中計算各樣品中VEN、ODV、AVA 的質(zhì)量濃度，再用Origin 9.0 軟件繪制大鼠單獨灌胃給予VEN、VIN及聯(lián)合灌胃給予VEN和VIN后血漿中VEN、ODV、AVA的平均血藥濃度-時間曲線。結(jié)果見圖4。

2.7 藥代動力學評價將經(jīng)過方法學驗證的分析方法用于本研究后，采用DAS2.0 軟件計算藥代動力學參數(shù)，然后應用SPSS19.0軟件對主要藥代動力學參數(shù)即峰濃度（cmax）、消除半衰期（t1/2）、藥時曲線下面積（AUC）、平均駐留時間（MRT）、清除速率（CL/F）、表觀分布容積（Vz/F）進行獨立樣本t 檢驗分析，達峰時間（tmax）采用非參數(shù)秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。結(jié)果見表3～表5。

由表3～表5 可見，與VEN組比較，VEN+VIN 組大鼠血漿中VEN、ODV 的藥代動力學參數(shù)cmax、AUC0 - t、AUC0-∞、MRT0-（t VEN除外）、MRT0-∞（VEN除外）均顯著增大，CL/F、Vz/F 均顯著減?。≒<0.05 或P<0.01）。與VIN 組比較，VEN+VIN 組大鼠血漿中AVA的各項藥代動力學參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

早期相關(guān)研究采用熒光法分析VEN及其代謝物[18]，但存在血漿樣品取樣量大、靈敏度不足、分析時間長的問題。鑒于生物樣品成分的復雜性，本研究建立的LC-MS/MS 法可減少干擾，具有專屬、高效、靈敏的特點。為獲得良好的峰形和較高的質(zhì)譜響應，筆者考察了流動相甲醇、乙腈、水的組成比例，并在水相中加入甲酸來提高離子化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當流動相為甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液（50 ∶45 ∶5，V/V/V）時，VEN、ODV、內(nèi)標的響應較高、峰形良好，VEN、ODV的保留時間均在1.95 min 內(nèi)，較文獻[19]中的保留時間更短;當流動相為甲醇-乙腈溶液（85 ∶15，V/V）時，AVA的峰形良好、響應較高且保留時間適宜。

前期研究階段，筆者考察了液液萃取法（萃取劑包括乙酸乙酯、甲基叔丁基醚）和蛋白沉淀法（沉淀劑包括甲醇、乙腈）對VEN、ODV血漿樣品預處理的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙酸乙酯萃取時，VEN、ODV的提取回收率較低;以甲醇和乙腈沉淀蛋白時，VEN、ODV的峰形變寬、柱效較低、重現(xiàn)性差，故采用甲基叔丁基醚作為萃取劑。另外，由于VEN、ODV偏堿性，故在樣品處理時加入碳酸鈉來提高兩者的提取回收率。筆者同樣也考察了液液萃取法（萃取劑包括乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶液）和蛋白沉淀法（沉淀劑包括甲醇、乙腈）對AVA血漿樣品預處理的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲基叔丁基醚、乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶液為萃取劑時，AVA的提取回收率較;以甲醇和乙腈沉淀蛋白時，AVA的峰形變寬、柱效較低、重現(xiàn)性差，故采用乙酸乙酯作為萃取劑。另外，由于AVA偏酸性，故在樣品處理時加入鹽酸來提高AVA的提取回收率

進一步的藥代動力學實驗結(jié)果顯示，與VEN 組比較，VEN + VIN 組中VEN、ODV 的藥代動力學參數(shù)AUC0-t、AUC0-∞、cmax、MRT0-（t VEN除外）、MRT0-∞（VEN除外）均顯著增大，CL/F、Vz/F均顯著減小，tmax、t1/2差異無統(tǒng)計學意義，提示VIN對VEN、ODV在大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為有影響。與VIN 組比較，VEN+VIN 組中AVA的藥代動力學參數(shù)cmax、AUC0-t、AUC0-∞、Vz/F、CL/F、tmax、t1/2、MRT0-t、MRT0-∞差異無統(tǒng)計學意義，提示VEN 對VIN 在大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為并無明顯影響。由此可知，VIN 可增大VEN、ODV的吸收程度，并使兩者的消除減慢，但對兩者的吸收速度無明顯影響。究其原因可能是由于VEN和ODV是經(jīng)CYP2D6 酶代謝的，而VIN 對CYP2D6 酶有一定的抑制作用，從而減慢VEN、ODV的代謝，造成兩者在體內(nèi)蓄積。由于VIN 的血管擴張作用可改善腦循環(huán)，并增強VEN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物利用度[14]，基于本研究結(jié)果筆者推測，VIN可能會導致VEN的中樞神經(jīng)濃度過高，進而產(chǎn)生不良反應。因此建議在臨床應用過程中，應適當調(diào)整VIN 和VEN 聯(lián)合用藥的劑量和給藥間隔，并密切關(guān)注兩者聯(lián)用期間患者的不良反應，以增加治療安全性。

綜上所述，VEN 和VIN 聯(lián)用后，VIN 可通過增大VEN、ODV在大鼠體內(nèi)的吸收程度、減慢兩者消除，影響VEN的代謝。