鉛、鎘單一及復(fù)合脅迫對(duì)生菜幼苗抗氧化酶及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的毒性效應(yīng)

林琳, 旦增卓嘎, 吳玲玲

同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092

近年來(lái),由于人類的活動(dòng),如電鍍、采礦、冶煉、燃燒、大氣沉積、使用無(wú)機(jī)肥料和殺蟲(chóng)劑等,使得大量重金屬進(jìn)入土壤中,污染土壤環(huán)境,造成嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。 有調(diào)查表明,我國(guó)受到污染的農(nóng)田中有82%的農(nóng)田土壤中含有Pb 和Cd[1]。 中國(guó)東部、南部和西部部分地區(qū)污染土壤中Pb 濃度超過(guò)了風(fēng)險(xiǎn)控制值(500 mg·kg-1)[2],湖南、云南、廣西、甘肅和遼寧農(nóng)田土壤中Cd 濃度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了篩選值(0.3 mg·kg-1)[3]。 目前農(nóng)田中重金屬污染問(wèn)題已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注[4-5]。 Pb、Cd 均為植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的非必需營(yíng)養(yǎng)元素,會(huì)對(duì)植物的種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生抑制作用,影響營(yíng)養(yǎng)元素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸和分布以及植物根系的含水量。 與此同時(shí),Pb、Cd 脅迫會(huì)引起植物細(xì)胞中抗氧化酶的應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸和蛋白質(zhì)含量的變化并造成細(xì)胞膜的過(guò)氧化損傷[6-7]。

以往的研究大多集中在探討單一重金屬脅迫對(duì)模式動(dòng)物、植物等的毒性效應(yīng)機(jī)制,然而,土壤重金屬污染往往具有伴生性和綜合性,絕對(duì)意義上的單一污染并不存在[8]。 與單一重金屬脅迫相比,重金屬?gòu)?fù)合脅迫可能會(huì)表現(xiàn)出不同的生物毒性效應(yīng)。 趙曉祥等[9]研究發(fā)現(xiàn),在Cd、Zn 復(fù)合脅迫下,番茄幼苗的葉綠素含量以及抗氧化系統(tǒng)均做出應(yīng)答改變,其中,低質(zhì)量比的Zn/Cd 復(fù)合脅迫對(duì)番茄幼苗表現(xiàn)出拮抗作用,而隨著施加質(zhì)量比的增加,Zn 與Cd 產(chǎn)生協(xié)同作用。 臺(tái)灣相思(Acacia confusa)屬豆科金合歡屬喬木,生長(zhǎng)周期快,抗逆性強(qiáng),為華南地區(qū)常見(jiàn)的木本園林植物[10]。 陳涵等[11]通過(guò)盆栽試驗(yàn),研究不同濃度Pb、Cd 復(fù)合脅迫對(duì)臺(tái)灣相思生長(zhǎng)、根系形態(tài)、養(yǎng)分元素和重金屬元素吸收的影響,結(jié)果表明,重金屬Pb、Cd 復(fù)合脅迫顯著增加臺(tái)灣相思根、莖及葉的 Pb、Cd 含量,此外,在高濃度下,Cd、Pb 元素之間存在拮抗作用,從而能夠抑制根系對(duì)Pb 的吸收。

生菜(Lactuca sativaL, lettuce)由于低熱量和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,常作為生食蔬菜,在世界范圍內(nèi)受到廣泛的喜愛(ài)[12-13]。 美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US EPA)將生菜規(guī)定為研究污染物的植物吸收與遷移的19 種標(biāo)準(zhǔn)植物之一[14]。 目前,生菜作為一種較為新穎的模式生物在毒理學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。 Hou 等[15]的研究指出,相較于玉米、小麥、黃瓜、卷心菜,生菜對(duì)Pb脅迫更為敏感,是探究土壤中Pb 對(duì)植物毒性效應(yīng)的一種較為合適的模式生物。 Li 等[16]研究 Pb、Cu對(duì)生菜的毒害效應(yīng)和亞細(xì)胞分布及其毒性機(jī)制,結(jié)果表明生菜根系中Pb 主要積聚在細(xì)胞壁中(41%),Cu 主要積聚在液泡中(46%)。 此外生菜也被用于探究Cd 脅迫下的生理響應(yīng)以及累積分布,為闡明Cd 對(duì)植物的毒性機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)[17]。 以往的研究大多集中于生菜對(duì)重金屬Pb、Cd 的吸收富集作用,關(guān)于Pb、Cd 單一及復(fù)合脅迫對(duì)生菜幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中抗氧化酶以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的毒性效應(yīng)仍存在空白。 因此,本研究采用生菜作為受試生物,通過(guò)水培實(shí)驗(yàn),探究Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露下對(duì)生菜幼苗期抗氧化系統(tǒng)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響,以期探索重金屬Pb、Cd 對(duì)生菜的毒性效應(yīng),為闡述重金屬Pb、Cd 對(duì)生菜的毒性效應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 生菜

供試生菜種子購(gòu)自上海農(nóng)樂(lè)種子企業(yè)店,為意大利全年耐抽苔生菜。

1.1.2 化學(xué)試劑

硝酸鎘·四水合物(Cd(NO3)2·4H2O)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、丙酮(C3H6O)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其中,Cd(NO3)2·4H2O 和 Pb(NO3)2為分析純,C3H6O 為色譜純。 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸酶(APX)、丙二醛(MDA)的檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置10個(gè)濃度,濃度的設(shè)置參考《農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5084—2021)[18],其中Pb 的濃度設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)(0.2 mg·L-1)的 1 倍、2 倍、5 倍和 10 倍,Cd 的濃度設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)(0.01 mg·L-1)的 2 倍,去離子水作為對(duì)照,即Pb 的單一暴露濃度設(shè)置為0.2、0.5、1.0 和 5.0 mg·L-1,Cd 的單一濃度設(shè)置為 0.02 mg·L-1,實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)如表1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)濃度的設(shè)置Table 1 Setting of experimental concentration

生菜種子用0.5%次氯酸鈉溶液消毒30 min 后用去離子水徹底洗凈,20 ℃在黑暗中靜置24 h 后,選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的生菜種子,放于相應(yīng)濃度的培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿里放30 粒種子,每個(gè)濃度設(shè)置9 組平行。 生長(zhǎng)溫度為(22±1) ℃,光暗比設(shè)為 16 h∶8 h,每天補(bǔ)充水分[19-20]。 在暴露第6 天、第10 天和第14天時(shí),采集植物葉片,測(cè)量葉綠素a和MDA 的含量及SOD、POD 和 APX 的活性,第14 天時(shí)采集生菜葉片,利用電子透射顯微鏡(TEM)觀察葉片細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葉綠素a含量

葉綠素a含量測(cè)定參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[21]和《水質(zhì) 葉綠素a的測(cè)定 分光光度法》(HJ 897—2017)[22]進(jìn)行改動(dòng),的方法,略作改動(dòng),具體方法如下:取0.02 g 生菜葉片,置于含有10 mL 90%丙酮的10 mL 離心管中,避光提取24 h,直至葉片發(fā)白,用紫外分光光度計(jì)(T6 新世紀(jì),北京普析,北京)分別在 750、664、647 和 630 nm 處測(cè)量其吸光度值,計(jì)算得到葉綠素a的含量,每個(gè)暴露濃度重復(fù)3 次。

1.3.2 抗氧化酶活性以及丙二醛含量的測(cè)定

取生菜葉片0.1 g,加入0.9 mL 磷酸緩沖液,在冰水浴條件下研磨成10%的勻漿,為了測(cè)量不同抗氧化酶的含量,將勻漿均勻分成2個(gè)部分,分別于4℃不同轉(zhuǎn)速下離心10 min。 其中轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 500 r·min-1的部分用于測(cè)定 MDA 含量、SOD 和 POD活性,轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 000 r·min-1的部分,用于測(cè)定APX 活性[20]。 離心后取上清液用于MDA 含量的檢測(cè)以及SOD、POD 和APX 活性的測(cè)定。

MDA 含量檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法,在532 nm 處測(cè)量吸光度值[23];SOD 活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法,在550 nm 處測(cè)量吸光度值[24];POD 活性的測(cè)定是利用POD 催化(H2O2)反應(yīng)的原理,通過(guò)測(cè)定420 nm 處吸光度的變化得到酶的活性[25];APX活性測(cè)定則利用APX 催化抗壞血酸(ASA)與H2O2反應(yīng),ASA 被氧化成單脫氫抗壞血酸(MDASA),通過(guò)測(cè)定ASA 在單位時(shí)間內(nèi)的減少值,計(jì)算得到APX 的活性[26]。 具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度均重復(fù)3 次上述操作。

1.3.3 生菜葉片切片及超微結(jié)構(gòu)的觀察

14 d 后取生菜葉片 2 mm2,用 0.1 mol·L-1、pH 7.0 的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次;用1%的鋨酸溶液固定樣品1 ~2 h;取出鋨酸廢液后,用0.1 mol·L-1、pH 7.0 的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次;乙醇系列濃度脫水,包埋劑包埋,包埋后的樣本在LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)中切片,切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5 ~10 min,晾干后在透射電鏡(Hitachi H-7650,日本)中觀察[19-27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(One way ANOVA)中的Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析,顯著性差異水平設(shè)置為P＜0.05。運(yùn)用 Origin 2018、Excel 2020 制圖。 Abott’s 公式用于評(píng)估Pb 和Cd 對(duì)生菜幼苗的復(fù)合毒性[28],其中,期望抑制率(Cexp)及復(fù)合脅迫表征值(RI)分別用下式表示。

式中:A、B分別表示單一Pb、Cd 脅迫所引起的抑制率,OI 為復(fù)合脅迫所引起的抑制率;RI 用于判斷Pb、Cd 對(duì)生菜的復(fù)合脅迫情況;RI＜1 表現(xiàn)為毒性拮抗,RI=1 表現(xiàn)為毒性簡(jiǎn)單相加,RI＞1 表現(xiàn)為毒性協(xié)同[9-29]。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 Pb、Cd 單一及復(fù)合脅迫對(duì)生菜幼苗葉綠素a的影響

如圖1 所示,在14 d 暴露過(guò)程中,對(duì)照組及暴露組生菜葉片中葉綠素a的含量隨暴露時(shí)間的增加而增加。 暴露第6 天時(shí),在Pb 單一暴露下,隨著暴露濃度的增加,葉綠素a的含量均表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì),葉綠素a含量的峰值出現(xiàn)在Pb 1.0 mg·L-1處;在 Pb、Cd 復(fù)合暴露下,Pb 1.0 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1復(fù)合暴露與同樣濃度的單一Pb 暴露相比葉綠素a的含量顯著性降低(P＜0.05),而其他復(fù)合暴露組與相同濃度的Pb 單一暴露相比,葉綠素a的含量沒(méi)有顯著性變化。 與單一Cd 暴露相比,在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,隨著Pb 濃度的增加,葉綠素a的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在 Pb 0.5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1時(shí),與單一Cd 脅迫相比葉綠素a含量顯著增加8.9%。

圖1 Pb、Cd 單一和復(fù)合暴露對(duì)生菜葉綠素a 含量的影響注:*表示生菜在不同濃度重金屬處理下差異顯著(P＜0.05);(a) Cd 的暴露濃度為0 mg·L-1,(b) Cd 的暴露濃度為0.02 mg·L-1。Fig.1 Chlorophyll a of lettuce after exposure to single and combined Pb and Cd stressNote: *mean significant differences between different heavy metal concentration groups (P＜0.05);two levels of Cd 0 mg·L-1 (a) and 0.02 mg·L-1 (b); the same below.

暴露至第10 天時(shí),在單一Pb 暴露下葉片中葉綠素a含量變化的趨勢(shì)與第6 天Pb 單一暴露下葉綠素a的變化趨勢(shì)一致;在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,當(dāng)Pb 濃度為 0.5、1 和 5 mg·L-1時(shí),Pb、Cd 復(fù)合暴露與同樣濃度的單一Pb 暴露相比葉綠素a的含量顯著下降,分別下降了5.3%、18.1%和9.1%;與單一Cd暴露相比,在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,葉綠素a的含量隨著Pb 濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)處于Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1復(fù)合暴露下時(shí),其葉綠素a的含量與單一Cd 暴露相比顯著下降(P＜0.05)。

暴露14 d 后,在Pb 單一暴露下,葉綠素a的含量隨著暴露濃度的增加仍表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì);不同于第6 天、第10 天的Pb 單一暴露,其最高值出現(xiàn)在單一 Pb 暴露0.5 mg·L-1處;在 Pb、Cd 復(fù)合暴露下,當(dāng) Pb 濃度為0.5 mg·L-1和5 mg·L-1時(shí),Pb、Cd 復(fù)合暴露與同樣濃度的單一Pb 暴露相比葉綠素a的含量顯著增加。 與單一Cd 暴露相比,在Pb、Cd復(fù)合脅迫下,隨著Pb 濃度的增加,葉綠素a的含量表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì),并且與單一Cd 暴露相比均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 Pb、Cd 單一及復(fù)合脅迫對(duì)生菜幼苗抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

2.2.1 SOD

第6 天時(shí),在 Pb、Cd 單一暴露下,各暴露組SOD 活性較對(duì)照組均受到顯著抑制(P＜0.05)。 在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,與相同濃度的單一Pb 暴露相比,SOD 活性沒(méi)有明顯變化;與單一Cd 暴露相比,在 Pb、Cd 復(fù)合暴露下,當(dāng) Pb≤0.5 mg·L-1時(shí) SOD 活性受到誘導(dǎo),在 Pb≥1 mg·L-1時(shí) SOD 活性受到抑制(圖 2)。

第10 天時(shí),在Pb 單一暴露下,與對(duì)照組相比,當(dāng)Pb≥1 mg·L-1時(shí),葉片中 SOD 活性受到顯著抑制(P＜0.05);在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,與相同濃度的單一Pb 暴露相比,SOD 活性無(wú)顯著性變化;與單一Cd 脅迫相比,Pb、Cd 復(fù)合脅迫下SOD 的活性也無(wú)顯著性變化(圖2)。

第14 天時(shí),在 Pb 單一暴露下,SOD 活性受到顯著抑制(P＜0.05),隨著Pb 單一暴露濃度的增加,葉片中SOD 的活性與第10 天葉片中SOD 的活性逐漸表現(xiàn)為同一水平;在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,在Pb相同暴露濃度下,Pb、Cd 復(fù)合暴露與Pb 單一暴露時(shí)葉片中SOD 活性沒(méi)有顯著區(qū)別;與單一Cd 暴露相比,隨著Pb 暴露濃度的增加,Pb、Cd 復(fù)合暴露下葉片中 SOD 的活性在 Pb≤0.5 mg·L-1時(shí)被誘導(dǎo),在Pb≥1 mg·L-1時(shí)受到抑制(圖 2)。

圖2 Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露對(duì)生菜葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注:*表示生菜在不同濃度重金屬處理下差異顯著(P＜0.05);(a) Cd 的暴露濃度為0 mg·L-1,(b) Cd 的暴露濃度為0.02 mg·L-1。Fig.2 Superoxide dismutase (SOD) activity of lettuce leaves after exposure to single and combined Pb and Cd stressNote: *mean significant differences between different heavy metal concentration groups (P＜0.05); two levels of Cd 0 mg·L-1(a) and 0.02 mg·L-1(b).

2.2.2 POD

如圖3 所示,在同一暴露濃度下,隨著暴露時(shí)間的增加,葉片中POD 的活性受到誘導(dǎo)。 第6 天時(shí),在 Pb 單一暴露下,當(dāng) Pb 濃度≥5 mg·L-1時(shí),POD的活性與對(duì)照組相比表現(xiàn)出顯著性增加(P＜0.05);相同Pb 暴露濃度下,Pb、Cd 復(fù)合暴露與單一Pb 暴露相比,葉片中POD 活性沒(méi)有顯著性差異;與單一Cd暴露相比,在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,當(dāng)Pb 濃度為5 mg·L-1時(shí),POD 活性受到顯著性誘導(dǎo)(P＜0.05)。

第10 天時(shí),在Pb 單一暴露下,隨著Pb 濃度的增加,POD 活性受到誘導(dǎo);當(dāng)Pb 濃度為0.2 mg·L-1和5 mg·L-1時(shí),與相同濃度的單一Pb 暴露相比,Pb、Cd 復(fù)合暴露下的 POD 活性受到誘導(dǎo);Pb、Cd 復(fù)合暴露下,與單一Cd 暴露相比,當(dāng)Pb 濃度≥1 mg·L-1時(shí),POD 活性受到誘導(dǎo)(圖 3)。

第14 天時(shí),在 Pb 單一暴露下,當(dāng) Pb≥0.5 mg·L-1時(shí),與對(duì)照組相比,POD 活性受到誘導(dǎo);在相同的Pb 暴露水平下,只有當(dāng)Pb 濃度為0.2 mg·L-1時(shí),Pb、Cd 復(fù)合暴露下POD 活性與Pb 單一暴露相比受到誘導(dǎo)(P＜0.05),其余復(fù)合暴露組與Pb 單一暴露組在相同Pb 濃度下,POD 活性無(wú)顯著性差異;與單一Cd 暴露相比,當(dāng) Pb≥1 mg·L-1時(shí),Pb、Cd 復(fù)合暴露下POD 活性被顯著誘導(dǎo)(圖3)。

圖3 Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露對(duì)生菜葉片過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響注:*表示生菜在不同濃度重金屬處理下差異顯著(P＜0.05);(a) Cd 的暴露濃度為0 mg·L-1,(b) Cd 的暴露濃度為0.02 mg·L-1。Fig.3 Peroxidase (POD) activity of lettuce leaves after exposure to single and combined Pb and Cd stressNote:*mean significant differences between different heavy metal concentration groups (P＜0.05); two levels of Cd 0 mg·L-1(a) and 0.02 mg·L-1(b).

2.2.3 APX

對(duì)照組葉片中APX 活性隨著暴露時(shí)間的增加而增強(qiáng),在Pb 單一脅迫下,隨著Pb 暴露濃度的增加,其葉片中APX 的活性在第6 天、第10 天均表現(xiàn)出“低促高抑”的趨勢(shì),然而當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)至14 d,葉片中APX 的活性隨著暴露濃度的增加而被顯著抑制。 第6 天時(shí),Pb、Cd 復(fù)合暴露與相同濃度的單一Pb 暴露相比,葉片中APX 活性無(wú)顯著性變化;與單一Cd 暴露相比,當(dāng)生菜處于Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1暴露下,APX 活性受到顯著抑制。 第10 天時(shí),當(dāng) Pb≥1 mg·L-1,Pb、Cd 復(fù)合暴露與單一Pb 暴露相比,APX 活性受到顯著抑制;與單一Cd暴露相比,在 Pb、Cd 復(fù)合暴露下,當(dāng) Pb≥5 mg·L-1時(shí),APX 活性受到抑制。 第14 天時(shí),當(dāng)重金屬暴露濃度相同時(shí),Pb、Cd 復(fù)合暴露葉片中APX 的活性與第6 天和第10 天葉片中APX 的活性相比均受到顯著抑制,并且隨著重金屬暴露程度的增加,APX 活性受到抑制的程度也逐步增加(圖4)。

圖4 Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露對(duì)生菜葉片抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性的影響注:*表示生菜在不同濃度重金屬處理下差異顯著(P＜0.05);(a) Cd 的暴露濃度為0 mg·L-1,(b) Cd 的暴露濃度為0.02 mg·L-1。Fig.4 Ascorbate peroxidase (APX) activity of lettuce leaves after exposure to single and combined Pb and Cd stressNote:*mean significant differences between different heavy metal concentration groups (P＜0.05); two levels of Cd 0 mg·L-1(a) and 0.02 mg·L-1(b).

2.2.4 MDA

在6 ~14 d 暴露過(guò)程中,對(duì)照組生菜葉片中MDA 的含量維持在較低水平,基本不變,而暴露組生菜葉片中MDA 的含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),在同一暴露濃度下,隨著暴露時(shí)間的增加,暴露組葉片中MDA 的含量也隨之增加。 在暴露第6天、第10 天和第14 天,生菜葉片中MDA 的含量均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。 在Pb 單一暴露下,隨著Pb 暴露濃度的增加,MDA 含量隨之增加;當(dāng)Pb 暴露濃度相同時(shí),在Pb、Cd 復(fù)合暴露下葉片中MDA 的含量與Pb 單一暴露下MDA 含量相比,無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 Cd 單一暴露下葉片中 MDA 含量顯著高于對(duì)照組葉片中MDA 的含量,與單一Cd 暴露相比,在 Pb、Cd 復(fù)合暴露下隨著 Pb 濃度的增加,葉片中MDA 的含量呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢(shì),最小值出現(xiàn)在 Pb 0.2 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1處(圖 5)。

圖5 Pb、Cd 單一和復(fù)合暴露對(duì)生菜葉片丙二醛(MDA)含量的影響注:*表示生菜在不同濃度重金屬處理下差異顯著(P＜0.05);(a) Cd 的暴露濃度為0 mg·L-1,(b) Cd 的暴露濃度為0.02 mg·L-1。Fig.5 Malondialdehyde (MDA) content of lettuce leaves after exposure to single and combined Pb and Cd stressNote: *mean significant differences between different heavy metal concentration groups (P＜0.05); two levels of Cd 0 mg·L-1(a) and 0.02 mg·L-1(b).

2.2.5 聯(lián)合毒性分析

根據(jù)公式(1)、(2)計(jì)算復(fù)合脅迫下生菜的葉綠素a含量、MDA、POD、SOD 和 APX 的 RI 值,計(jì)算結(jié)果顯示,除了除第 14 天時(shí),5.0 mg·L-1Pb 和 0.02 mg·L-1Cd 復(fù)合脅迫下,對(duì)APX 酶的活性表現(xiàn)出協(xié)同作用,其余Pb 和Cd 復(fù)合脅迫的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為拮抗作用(圖6)。

圖6 Pb、Cd 復(fù)合脅迫下聯(lián)合毒性復(fù)合脅迫表征值的變化Fig.6 Changes of ratio of inhibition under combined stress of Pb and Cd

2.3 Pb、Cd 單一及復(fù)合脅迫對(duì)生菜葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

暴露14 d 后,制作生菜葉片切片,于TEM 下觀察生菜葉片的超微結(jié)構(gòu)。

如圖7 所示,在對(duì)照組(圖7(a)和圖7(b))的生菜細(xì)胞的細(xì)胞壁和各細(xì)胞器在電子顯微鏡下結(jié)構(gòu)完整,清晰可見(jiàn)。 葉綠體排列有序,呈現(xiàn)梭形或橢圓形,淀粉粒含量較多,類囊體片層垛疊整齊。 線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu),基質(zhì)均勻,可以觀察到內(nèi)膜凹陷所形成的嵴。 各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整。

在Pb 5 mg·L-1單一暴露時(shí)(圖7(c)和圖7(d)),細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整。 細(xì)胞器與對(duì)照組相比變化明顯,主要表現(xiàn)為:葉綠體數(shù)量減少,形狀由梭形變成半月形或圓形,且膜邊緣開(kāi)始模糊;淀粉粒數(shù)量減少,嗜鋨顆粒變大,部分類囊體開(kāi)始膨脹,內(nèi)部結(jié)構(gòu)趨于瓦解。 線粒體的結(jié)構(gòu)遭到破環(huán),內(nèi)部出現(xiàn)大量空泡,且空泡化較嚴(yán)重,外膜破裂,嵴的結(jié)構(gòu)不清晰;核內(nèi)容物呈現(xiàn)無(wú)序狀態(tài),染色體凝集。

單一 Cd(0.02 mg·L-1)暴露 14 d 后(圖 7(e)和圖7(f)),生菜葉片細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)聚集的黑色顆粒,葉綠體結(jié)構(gòu)基本完好,部分葉綠體被膜出現(xiàn)外膜破裂的情況。 線粒體結(jié)構(gòu)受到破壞,外膜破裂,無(wú)結(jié)構(gòu)清晰的嵴,且出現(xiàn)輕度空泡化。

Pb、Cd 復(fù)合暴露下(圖 7(g)),與單一 Pb 5 mg·L-1、單一Cd 0.02 mg·L-1暴露相比,生菜葉片細(xì)胞的葉綠體損傷加劇,其基質(zhì)和類囊體的結(jié)構(gòu)模糊不清,有空泡出現(xiàn),功能結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p害,線粒體空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重,但未在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到黑色顆粒。

圖7 Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露下對(duì)生菜葉片亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響注:(a)、(b) CK;(c)、(d) Pb 5 mg·L-1;(e)、(f) Cd 0.02 mg·L-1;(g) Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1;Ch 為葉綠體;Mi 為線粒體;Th 為類囊體;N 為細(xì)胞核;OG 為嗜鋨顆粒。Fig.7 Single and combined stress effects of Pb and Cd on subcellular structure of lettuce leavesNote: (a), (b) CK; (c), (d) Pb 5 mg·L-1; (e), (f) Cd 0.02 mg·L-1; (g) Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1; Ch stands for chloroplast;Mi stands for mitochondrion; Th stands for thylakoid; N stands for nucleus; OG stands for osmium granule.

3 討論(Discussion)

葉綠素在光合作用中起著捕獲光的作用,是光合色素中重要的色素,參與光合作用中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化,在光合作用中占有重要地位,是植物代謝的重要物質(zhì)[30-31]。 因此,葉綠素含量的高低能夠反映光合作用水平的強(qiáng)弱[32],被廣泛用于評(píng)價(jià)重金屬暴露對(duì)植物的毒性效應(yīng)。 本研究中,在Pb 單一及Pb、Cd 復(fù)合暴露下,生菜葉片中葉綠素的含量均發(fā)生顯著變化,呈現(xiàn)出“低促高抑”的趨勢(shì)。 賴長(zhǎng)鴻等[33]研究As(Ⅲ)暴露對(duì)生菜的影響中發(fā)現(xiàn),隨著As(Ⅲ)暴露濃度的增加,生菜葉片葉綠素的含量呈現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”,這與本研究結(jié)果相一致。 然而孫健等[34]的研究結(jié)果顯示,在重金屬Cu、Cd、Pb、Zn 和 As 復(fù)合脅迫下,燈心草葉綠素含量隨重金屬?gòu)?fù)合暴露濃度的增加而下降明顯。 這可能是因?yàn)樯藢?duì)低濃度Pb 脅迫具有一定的耐受性,并且Pb、Cd 復(fù)合暴露對(duì)葉綠素的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗效應(yīng),降低重金屬向地上部的遷移,從而減緩了重金屬對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞。

重金屬脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS),從而對(duì)細(xì)胞的正常代謝過(guò)程造成負(fù)面的影響,植物細(xì)胞中存在的抗氧化酶(SOD、POD 和APX)可清除過(guò)量ROS,從而使植物維持正常生理活動(dòng),提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[35]。

SOD 普遍存在于植物體內(nèi),是植物細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線,SOD 能夠催化超氧陰離子的歧化反應(yīng),并將其歧化為H2O2和O2[20]。 本實(shí)驗(yàn)中,在Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露下,各暴露組生菜葉片細(xì)胞中SOD 活性被抑制,這與賈月慧等[17]的研究結(jié)果一致,該研究表明,生菜對(duì)Cd 脅迫響應(yīng)時(shí),隨著Cd 濃度的增加,生菜葉片細(xì)胞中SOD 活性顯著降低。 陳順鈺等[36]的研究表明,在 Pb 單一暴露的第 0 天、第 4 天、第 7 天和第 10 天楓香 SOD 的活性先減后增,而在同一時(shí)間,隨著Pb 暴露濃度的增加,SOD 的活性則表現(xiàn)出“升高-降低-升高”的趨勢(shì)。 本研究中,同一暴露濃度下,大部分暴露組生菜葉片在生長(zhǎng)過(guò)程中,葉片中SOD 的活性被誘導(dǎo),表明生菜應(yīng)對(duì)重金屬Pb、Cd 脅迫的能力增強(qiáng),但在第14 天,Pb 單一暴露濃度為 5 mg·L-1時(shí),SOD 活性下降到與第10 天同一水平,表明長(zhǎng)時(shí)間高濃度的Pb暴露會(huì)在很大程度上抑制生菜葉片SOD 的活性;在同一暴露時(shí)間,Pb 單一暴露下,隨著暴露濃度的增加,SOD 活性受到抑制,在Pb、Cd 復(fù)合脅迫下,SOD活性則表現(xiàn)出“升高-降低”的趨勢(shì),清除ROS 以達(dá)到保護(hù)自身的目的。

為清除H2O2,植物細(xì)胞可以利用POD 和APX將 H2O2轉(zhuǎn)化成 H2O 和田丹等[38]在研究 Cd脅迫對(duì)生菜幼苗抗氧化酶系統(tǒng)影響時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著Cd暴露濃度的增加,生菜葉片POD 活性受到顯著誘導(dǎo)。 與此相類似,在本研究中,POD 活性在暴露第6天、第10 天和第14 天均表現(xiàn)出相同的應(yīng)答反應(yīng),即在單一 Pb 暴露下,隨著 Pb 濃度的升高,葉片中POD 的活性受到顯著誘導(dǎo);在Cd 單一暴露下,POD的活性受到誘導(dǎo);在Pb、Cd 復(fù)合暴露下,POD 的活性也隨著脅迫程度的增加而受到誘導(dǎo),以此降低自由基的產(chǎn)生速率,從而減活性氧對(duì)細(xì)胞膜脂的傷害。APX 是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一,可以緩解自由基造成的膜脂過(guò)氧化的傷害。 本研究表明,在暴露前期(第6 天、第10 天)APX 在緩解膜脂過(guò)氧化傷害中,起到了重要的作用,這與楊波等[39]發(fā)現(xiàn)的Cd 脅迫對(duì)三葉鬼針草APX 酶活的影響一致,重金屬Cd 對(duì)APX 活性的影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制,而隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),即使在較低的濃度下,APX 的活性仍會(huì)受到較大的影響。 此外,有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)生菜處于0 ~15 mg·L-1的 Cd 脅迫下時(shí),隨著Cd 脅迫濃度的增加,生菜葉片中APX酶的活性受到誘導(dǎo)[38],與本研究隨著Pb 濃度的增加生菜APX 活性“低促高抑”表現(xiàn)不一致,這可能是因?yàn)橹亟饘俜N類以及暴露時(shí)間不同。 第14 天時(shí),APX 的活性隨著暴露濃度的增加而受到顯著抑制,生菜細(xì)胞中 SOD、POD 應(yīng)對(duì)重金屬 Pb、Cd 脅迫產(chǎn)生的ROS 的作用開(kāi)始變大。 在復(fù)合脅迫下,APX的活性隨時(shí)間變化逐漸受到抑制,說(shuō)明在較高濃度的Pb、Cd 復(fù)合脅迫下,APX 的活性受到顯著的抑制,生菜葉片細(xì)胞中的APX 相較于SOD、POD 對(duì)重金屬脅迫更加敏感。

MDA 是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物,其含量越高,表明膜脂過(guò)氧化程度越高,細(xì)胞膜受到的損傷越嚴(yán)重。 大量研究表明,植物在受到重金屬脅迫時(shí),會(huì)導(dǎo)致活性氧的大量積累,損傷細(xì)胞膜,致使膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物的增加,從而導(dǎo)致MDA 含量上升[40-43]。在本研究中,在重金屬Pb、Cd 單一及復(fù)合暴露下,葉片中MDA 含量均有不同程度的增加,表明細(xì)胞膜受到了不同程度的損傷。 在Pb 單一脅迫下,隨著暴露濃度的升高,MDA 的含量上升,呈正相關(guān),表明隨著Pb 脅迫強(qiáng)度的增加,細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度加深,細(xì)胞膜受到損傷的程度加劇;而在Pb、Cd復(fù)合脅迫下,當(dāng)Pb 濃度一致時(shí),其MDA 含量低于Pb 單一暴露組,在此濃度下,可能是因?yàn)镻b、Cd 之間存在相互競(jìng)位點(diǎn),Pb、Cd 復(fù)合脅迫表現(xiàn)為拮抗作用,減緩了Pb 單一脅迫對(duì)生菜的毒性效應(yīng)。

通過(guò)TEM,可以更直接地觀察在 Pb、Cd 脅迫下,生菜細(xì)胞所受到的損傷。 在本研究中,在Pb、Cd單一及復(fù)合脅迫下均可以觀察到生菜葉片中葉綠體的結(jié)構(gòu)遭到破壞,線粒體空泡化,染色質(zhì)出現(xiàn)不同程度的凝縮。 葉綠體以及細(xì)胞膜受到損害的程度為Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1＞Pb 5 mg·L-1＞Cd 0.02 mg·L-1,14 d 時(shí),Cd 0.02 mg·L-1暴露下生菜葉片中SOD、APX 的活性均高于 Pb 5 mg·L-1的單一暴露以及 Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1的復(fù)合暴露,此時(shí),Cd 單一暴露下生菜葉片細(xì)胞清除ROS 的能力要強(qiáng)于Pb 5 mg·L-1的單一暴露以及Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1的暴露,從而導(dǎo)致細(xì)胞膜受到的損害程度輕于這2個(gè)暴露組,MDA 的含量也低于這2個(gè)暴露組。 此外,在0.02 mg·L-1Cd 單一脅迫下,細(xì)胞中出現(xiàn)了黑色顆粒,趙雅曼等[44]在研究中發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下寬葉雀稗細(xì)胞中積聚很多黑色顆粒,并通過(guò)能譜分析證實(shí)這些黑色顆粒物的主要成分是Cd,與此相類似,在本實(shí)驗(yàn)中,Cd 脅迫下生菜葉片中出現(xiàn)的黑色顆粒很可能是因?yàn)镃d 顆粒進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞質(zhì)中累積;而在 Pb 5 mg·L-1+Cd 0.02 mg·L-1脅迫下,細(xì)胞中并沒(méi)有出現(xiàn)黑色顆粒,可能是因?yàn)樵诖藵舛认?Pb、Cd 之間產(chǎn)生相互作用,一定程度上阻止了Cd 進(jìn)入生菜葉片細(xì)胞中,前文RI 分析表明,Pb、Cd 復(fù)合脅迫的毒性效應(yīng)為拮抗作用,與此相印證。