混菌順序發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒品質(zhì)的影響

劉曉燕，趙曉敏，張小月，李雪梅，蔡軍社，李斌斌，姚 瑤，李學文

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆 吐魯番 838200；3.新疆農(nóng)墾科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000；4.中華人民共和國霍爾果斯海關(guān)，新疆 霍爾果斯 835221）

酵母是決定葡萄酒最終質(zhì)量的重要因素之一，不同釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株的代謝產(chǎn)物存在差異，因而影響葡萄酒的風味和獨特性[1]。隨著葡萄酒市場的發(fā)展，單一釀酒酵母發(fā)酵使葡萄酒同質(zhì)化問題逐漸突出，與此同時因地理位置環(huán)境特征等因素新疆產(chǎn)區(qū)的葡萄酒普遍存在糖高酸低褪色快等問題，混菌發(fā)酵有助于改善葡萄酒的顏色、香氣和口感，一定程度上解決新疆產(chǎn)區(qū)的問題，近年非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）受到越來越多的關(guān)注[2]，研究發(fā)現(xiàn)耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）能夠增加葡萄酒酸度，降低pH值[3-4]，Lachancea thermotolerans與Saccharomyces cerevisiae共同發(fā)酵發(fā)現(xiàn)其可提高葡萄酒的乳酸含量[5]，而酸度對葡萄酒的顏色、口感、穩(wěn)定性、風味指數(shù)、總酚、單寧都有直接的影響[6]，但非釀酒酵母大多發(fā)酵力弱，耐酒精能力有限，無法單獨完成發(fā)酵[7]，因此通常將其與釀酒酵母混合發(fā)酵?；旌习l(fā)酵更有利于葡萄酒香氣物質(zhì)的產(chǎn)生[8-10]，因為它們可以在與釀酒酵母混合發(fā)酵中生成特定的香氣化合物，并產(chǎn)生高活性的聚半乳糖醛酸酶和β-D-木糖苷酶，可提高果酒質(zhì)量、增加葡萄酒的復雜性[11-12]，金宇寧[13]研究發(fā)現(xiàn)，酵母PL09發(fā)酵冰葡萄酒能產(chǎn)生較多香氣物質(zhì)。此外，有研究表明，用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）發(fā)酵可增加紅葡萄酒整體吡喃花青素的含量[14]，非釀酒酵母在連續(xù)發(fā)酵過程中具有較高的羥基肉桂酸脫羧酶活性[15]，均可以增加葡萄酒色素的穩(wěn)定性。關(guān)于非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對葡萄酒品質(zhì)影響的研究多集中在香氣物質(zhì)的分析，而對葡萄酒顏色以及酚類物質(zhì)影響的研究相對較少。

因此，本研究以新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄為原料，主要采用2種非釀酒酵母（CT10、PL09）分別與3種釀酒酵母（MST、CEC01、F33）順序發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，通過監(jiān)測酒精發(fā)酵過程及蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后的顏色、酚類物質(zhì)的變化及感官品評，分析不同非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)生的影響與差異，以期為提高葡萄酒品質(zhì)以及非釀酒酵母的利用和選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄（含糖量（以還原糖計）為251.00 g/L，可滴定酸（以酒石酸計）為5.25 g/L）：2020年9月采自新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)冰湖酒莊。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）MST、CEC01、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）CT10、布魯塞爾德克酵母（Dekkera bruxellensis）PL09：上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）F33、酒酒球菌（Oenococcus oeni）：法國Laffort公司。

無水葡萄糖、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純）、沒食子酸、蘆?。兌龋?8%）：天津市致遠化學試劑有限公司；鹽酸、碳酸鈉、磷酸（均為分析純）：天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；福林-酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C精密pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DZKW-S-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TU-1810APC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DW-40L 92海爾醫(yī)用低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母的活化

非釀酒酵母的活化：分別稱取適量非釀酒酵母CT10、PL09，用10倍酵母質(zhì)量的20～25 ℃蒸餾水進行活化，然后添加約3倍于復水液的無硫葡萄汁中，制備成酵母懸浮液，靜置20 min，完成非釀酒酵母活化。

釀酒酵母的活化：將純水加熱至35～40 ℃，分別稱取適量釀酒酵母MST、CEC01、F33加入其中，輕柔攪拌后靜置15～20 min，完成釀酒酵母活化。

1.3.2 赤霞珠干紅葡萄酒的制備及不同酵母的添加方式

赤霞珠釀酒葡萄去除雜質(zhì)，除梗破碎后入60 L不銹鋼桶（裝罐量約80%），將亞硫酸鹽溶解于去離子水中并按照30 mg/L添加，分別接入活化好的非釀酒酵母0.25 g/L，每隔5 h進行一次開放式循環(huán)操作，48 h后以1∶1分別接入活化好的釀酒酵母0.25 g/L，順序接種進行常溫（室溫22～24 ℃）發(fā)酵，每天進行溫度比重監(jiān)測，分別在發(fā)酵前期（添加酵母前，起始比重為1 105），發(fā)酵中期（比重下降至1 050），發(fā)酵末期（比重不再下降時）取樣，酒精發(fā)酵結(jié)束后接入乳酸菌啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵（室溫18～20 ℃），通過紙層析法檢測發(fā)酵進程，發(fā)酵結(jié)束后添加SO2（60 mg/L亞硫酸鹽）終止發(fā)酵，得到赤霞珠干紅葡萄酒。不同酵母的添加方式見表1。

表1 不同酵母的添加方式Table 1 Adding ways of different yeasts

1.3.3 分析檢測

（1）基本理化指標

總酸（以酒石酸計）、揮發(fā)酸（以乙酸計）、pH、總糖、酒精度、干浸出物、SO2等均參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

（2）顏色指標

色度、色調(diào)參照郝笑云[16]的方法，其中色度為波長420nm、520nm、620nm處吸光度值之和，色調(diào)為波長420nm、520nm吸光度值之比值；總色素（totalcolorofpigments，WCP）：在1 mL酒樣中加入9 mL 0.1 mol/L HCl，pH＜1，4～5 h后測波長520 nm處吸光度值；葡萄酒顏色（wine color，WC）：在2 mL酒樣中加入20 μL乙醛，45 min后測波長520 nm處吸光度值；聚合色素（polymeric pigment color，PPC）[17]：5 mL酒樣中添加15 mg NaHSO3，1 min后測波長520 nm處的吸光度值。

（3）酚類物質(zhì)

總酚（以沒食子酸計）：參照魯榕榕[18]福林-酚（Folin-Ciocalten）比色法；單寧：參照RAJKOVICˊM B等[19]的方法；總花色苷：參照翦祎等[20]的pH示差法；總類黃酮（以蘆丁計）：參照楊雪峰等[21]氯化鋁比色法。

（4）感官分析

感官品評方法以美國葡萄酒協(xié)會（American Wine Society，AWS）的葡萄酒品嘗表[22]為評價標準見表2。評酒人員由10名本校葡萄酒專業(yè)的學生和老師組成（6名男性，4名女性，年齡范圍為20～40歲之間），在相同條件下對混菌順序發(fā)酵的葡萄酒進行5個方面的感官品評，每方面的得分由高到低表示該項感官由強至弱，總分為20分。

表2 赤霞珠干紅葡萄酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Cabernet Sauvignon dry red wine

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析、相關(guān)性分析，應用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中比重、溫度及酒精度的變化

各酒樣發(fā)酵過程中比重、溫度、酒精度變化結(jié)果見圖1。由圖1a可知，起始發(fā)酵時3種釀酒酵母啟動發(fā)酵快于先接種非釀酒酵母的處理，其中釀酒酵母CEC01啟動發(fā)酵最快，發(fā)酵2d后比重下降幅度增加，發(fā)酵5d后酒樣MST-1與CEC01-1趨于同步，酒樣F33-1比重下降較緩慢，發(fā)酵第9天比重不變，表明3種釀酒酵母酒精發(fā)酵結(jié)束，而混菌發(fā)酵的酒樣比重下降幅度較緩慢。由圖1b可知，發(fā)酵第2天時接種釀酒酵母進行混菌發(fā)酵后溫度變化幅度增大，發(fā)酵至第4天溫度達到最高值，但低于釀酒酵母發(fā)酵溫度，且下降幅度較慢，發(fā)酵至12 d時比重與溫度基本保持穩(wěn)定，結(jié)束酒精發(fā)酵。通過觀察發(fā)酵進程可知，非釀酒酵母完成酒精發(fā)酵所需時間較長，這與張曼等[23]研究結(jié)果一致，體現(xiàn)非釀酒酵母發(fā)酵能力弱的特點。由圖1c可知，發(fā)酵初期酒樣CEC01-1酒精度上升最快，酒樣MST-1、F33-1次之，發(fā)酵至第9天逐漸趨于平穩(wěn)，混菌發(fā)酵酒樣則在發(fā)酵第3天時酒精度開始大幅上升，發(fā)酵至第11天時逐漸趨于平穩(wěn)，除酒樣PF外，其他混菌發(fā)酵酒樣酒精度高于均對照組。

圖1 發(fā)酵過程中比重（a）、溫度（b）及酒精度（c）的變化Fig.1 Changes of specific gravity (a),temperature (b) and alcohol content (c) during fermentation process

2.2 混菌順序發(fā)酵對葡萄酒理化指標的影響

由表3可知，各酒樣理化指標均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的標準?；炀l(fā)酵與單菌發(fā)酵的葡萄酒相比總酸含量升高，其中A組總酸含量整體較高均在4.13 g/L以上，其中酒樣CC比對照組提高了6.25%，B組中酒樣PM比對照組提升5.97%，酒樣PC最高達到4.31g/L，比對照組提升7.75%，差異性顯著（P＜0.05），A和B兩組的pH隨總酸的變化呈現(xiàn)出相應的規(guī)律性，且低于對照組（酒樣CM除外）；酒樣CM、PM、PC酒精度顯著高于對照（P＜0.05），酒樣CM、CF、PF干浸出物含量顯著高于對照組（P＜0.05），其中酒樣CF酒精度及干浸出物含量達到最高，酒樣F33-1及CF、PF干浸出物顯著高于其他處理組（酒樣CM除外）（P＜0.05）；表明混菌發(fā)酵有利于提升葡萄酒總酸及干浸出物的含量，這與何曉麗等[24]的研究結(jié)果相似。

表3 混菌順序發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒理化指標Table 3 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon dry red wines by sequential fermentation with mixed yeasts

2.3 混菌順序發(fā)酵對葡萄酒顏色的影響

2.3.1 混菌順序發(fā)酵對葡萄酒色度、色調(diào)的影響

各葡萄酒酒樣色度、色調(diào)的測定結(jié)果見圖2。

圖2 混菌順序發(fā)酵赤霞珠葡萄酒的色度（a）及色調(diào)（b）Fig.2 Chroma (a) and hue (b) of Cabernet Sauvignon wines by sequential fermentation with mixed yeasts

由圖2a可知，隨著酒精發(fā)酵的進行色度呈上升趨勢，說明各酒樣顏色在向紅色調(diào)轉(zhuǎn)移，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后色度略有下降，酒樣CM、PM的色度顯著高于對照組（P＜0.05），其他酵母組合色度值均顯著低于對照組（P＜0.05），這可能是酵母對酒樣顏色得吸附作用引起的[25]；色調(diào)值越高表明酒的色調(diào)越偏向黃色，越低越偏向于紅色[26]。由圖2b可知，酒精發(fā)酵過程中色調(diào)的變化先下降而后略有上升，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后色調(diào)值發(fā)生小幅上升，表明酒樣黃色調(diào)略有增加，其中酒樣CC、CF顯著低于對照組和B組酒樣（P＜0.05），王玉華等[27]研究發(fā)現(xiàn)，L.thermotolerans與S.pombe順序接種發(fā)酵能夠提升美樂干紅葡萄酒色度降低色調(diào)，與本研究結(jié)果相似，這可能與酵母細胞壁對葡萄酒顏色的吸附作用有關(guān)[28]，且添加增酸非釀酒酵母吸附效果較為突出，表明與增酸非釀酒酵母混菌發(fā)酵有固色作用。

2.3.2 混菌順序發(fā)酵對葡萄酒WCP、WC、PPC值的影響

各葡萄酒酒樣WCP、WC、PPC值的測定結(jié)果見圖3。WCP與游離態(tài)的花色苷密切相關(guān)，WC包含了易被氧化的花色苷，PPC則是單體花色苷與酚類物質(zhì)間相互作用聚合而成的多酚[29]。由圖3a可知，混菌順序發(fā)酵葡萄酒總色素在酒精發(fā)酵期間呈不斷上升趨勢，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后各酒樣總色素略有下降，其中酒樣MST-1、CEC01-1、PF下降幅度相對較少。由圖3b可知，葡萄酒顏色在酒精發(fā)酵階段不斷升高，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后則再次上升，對照組及酒樣CM升高較多，而除酒樣CM、PF外，其他組顯著低于對照組（P＜0.05）。由圖3c可知，聚合色素在酒精發(fā)酵期間總體表現(xiàn)為上升趨勢，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，酒樣MST-1、PM略有下降，其他組均有不同程度上升，其中酒樣F33-1最高，其次為酒樣PF，酒樣CM與PM則顯著高于酒樣MST-1（P＜0.05），說明適當?shù)幕炀l(fā)酵有利于穩(wěn)定葡萄酒的顏色，這一結(jié)果與BENITO á等[5]研究結(jié)果有相似之處。這可能是因為混菌發(fā)酵能夠促進葡萄糖苷特定前體物產(chǎn)量的增加，提高了穩(wěn)定色素葡萄糖苷的合成[30]。

圖3 混菌順序發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒的總色素（a）、葡萄酒顏色（b）及聚合色素（c）Fig.3 Total pigments (a),wine color (b),polymeric pigment (c) of Cabernet Sauvignon dry red wine by sequential fermentation with mixed yeasts

2.4 混菌順序發(fā)酵對葡萄酒酚類物質(zhì)含量的影響

各葡萄酒酒樣酚類物質(zhì)含量的測定結(jié)果見圖4。由圖4a可知，單寧含量隨酒精發(fā)酵的進行不斷上升，發(fā)酵末期混菌發(fā)酵酒樣單寧含量（酒樣PF除外）顯著高于對照（P＜0.05），蘋乳發(fā)酵結(jié)束后酒樣CEC01-1單寧含量大于其他兩種釀酒酵母，混菌發(fā)酵酒樣PF達到最高值3 550.28 mg/L，比酒樣F33-1上升17.74%，差異性顯著（P＜0.05），其次為酒樣CM，比酒樣MST-1上升12.30%。此外，不難發(fā)現(xiàn)A組單寧含量略高于B（酒樣PF除外）組，宋淑燕[31]研究發(fā)現(xiàn)，加酸對葡萄酒單寧含量略有提升作用，本研究中的現(xiàn)象則可能是因為生物增酸所導致的。

圖4 混菌順序發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒中單寧（a）、總酚（b）、總花色苷（c）及總類黃酮(d)含量Fig.4 Tannin (a),total phenols (b),total anthocyanins (c) and total flavonoids (d) contents in Cabernet Sauvignon dry red wine by mixed order fermentation

由圖4b可知，總酚含量隨酒精發(fā)酵的進行呈上升趨勢，發(fā)酵末期混菌發(fā)酵酒樣（PM、PF、CC）總酚含量顯著高于對照（P＜0.05），蘋乳發(fā)酵結(jié)束后酒樣PF總酚含量最高，其次為酒樣PC、CM，混菌發(fā)酵酒樣總酚含量高于對照（P＜0.05），酒樣CEC01-1除外，其中酒樣CM、PM比酒樣MST-1分別提升44.68%、50.96%，酒樣PF比F33-1提升20.96%，說明混菌順序發(fā)酵有提升葡萄酒中總酚含量的作用，而酒樣CC、PM、PF出現(xiàn)小幅下降，可能因為菌株的不同酵母細胞壁對酚類物質(zhì)的吸附作用有差異，因而出現(xiàn)降低的現(xiàn)象[32]，CARIDI A等[33]的研究也發(fā)現(xiàn)，不同菌株對葡萄酒酚類物質(zhì)保護作用不同。

由圖4c可知，總花色苷含量隨酒精發(fā)酵的進行基本呈不斷上升趨勢，發(fā)酵中期與末期變化趨勢基本相似，發(fā)酵末期A組酒樣與酒樣PM總花色苷含量顯著高于對照組（P＜0.05），蘋乳發(fā)酵結(jié)束后酒樣CM、PC、F33-1總花色苷含量持續(xù)上升，而酒樣PF下降19.81%，比酒樣F33-1低31.25%。其他混菌發(fā)酵酒樣總花色苷含量顯著高于對照組（P＜0.05），其中酒樣CM、PM分別比酒樣MST-1提升22.90%、9.90%，酒樣CC、PC分別比酒樣CEC01-1提升19.40%、20.60%，說明非釀酒酵母與釀酒酵母順序接種發(fā)酵有利于總花色苷的浸出，可能是因為總花色苷在這些酵母細胞壁上的吸收較低，或推遲了聚合過程[33]。

由圖4d可知，隨酒精發(fā)酵的進行總類黃酮不斷地被浸出，到達發(fā)酵末期混菌發(fā)酵效果更為明顯，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，酒樣CM、PF、CEC01-1含量較高，酒樣CM、PM比MST-1分別升高19.02%、5.59%，酒樣CF、PF比F33-1分別升高10.88%、15.34%，差異性顯著（P＜0.05），說明混菌順序發(fā)酵對葡萄酒中總類黃酮含量略有提升作用，這可能同樣是因為總類黃酮在這些酵母壁上的吸收較低，因而呈現(xiàn)出較高的含量[33]。

2.5 感官評價

各葡萄酒酒樣感官評價結(jié)果見表4。由表4可知，混菌順序發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒感官質(zhì)量有較大的影響，混菌發(fā)酵的葡萄酒總分顯著高于純釀酒酵母發(fā)酵酒（P＜0.05），對照組總分在12.65～14.04分，混菌發(fā)酵酒樣總分則在15.67～17.18分，根據(jù)AWS法評價分別為“好”和“優(yōu)秀”，這與FRESNO J M D等[30]研究結(jié)果相似，從外觀得分可以看出混菌發(fā)酵可評價為“好”，說明混菌發(fā)酵比單一酵母發(fā)酵酒的外觀品質(zhì)好，而外觀品質(zhì)與顏色品質(zhì)息息相關(guān)；香氣得分中混菌發(fā)酵酒樣總分在5.34～5.73分，可評價為“優(yōu)秀”，而單一釀酒酵母發(fā)酵總分在4.06～4.38分，則評價為“好”，說明混菌發(fā)酵有利于葡萄酒香氣的提升；口感結(jié)構(gòu)得分中酒樣CM、PF得分分別為5.10～5.03分，可被評價為“優(yōu)秀”，其他混菌發(fā)酵酒樣得分在4.74～4.94分，對照組得分在4.00～4.29分，均可評價為“好”；后味（酒樣MST-1除外）和整體印象得分在2.00～2.34分與1.12～1.63分，均可評為“好”，但相對而言混菌發(fā)酵得分較單一酵母發(fā)酵酒高。綜上，說明混菌發(fā)酵比單一酵母發(fā)酵更有利于葡萄酒感官品質(zhì)的提升，且不同酵母效果差異明顯，其中酒樣CM、PF相比于其他酒樣的香氣更復雜，口感更圓潤飽滿。

表4 混菌順序發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒感官評價結(jié)果Table 4 Results of sensory evaluation of Cabernet Sauvignon dry red wines by sequential fermentation with mix yeasts

2.6 相關(guān)性分析

如表5所示，總酸與總花色苷、感官得分顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明總酸越高，葡萄酒中花色苷含量越高，而與酸對應的pH則與WC顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明高pH會使葡萄酒中不穩(wěn)定的花色苷增多，因此增酸有利于葡萄酒顏色的穩(wěn)定；酒精度與PPC、總花色苷、感官得分極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明較高的酒精度可以提升葡萄酒顏色的穩(wěn)定性以及感官得分；色度與WCP、WC、PPC極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；色調(diào)與PPC、總酚極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與總花色苷顯著負相關(guān)（P＜0.05）；PPC與總酚極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明總酚含量越高，聚合色素含量越高；總類黃酮與干浸出物、WCP、單寧、總酚極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；感官得分與PPC、總類黃酮顯著正相關(guān)（P＜0.05），與總酚極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明較高的酚類物質(zhì)含量可以使葡萄酒顏色更穩(wěn)定，得到更高的感官得分，從而得到品質(zhì)較好的葡萄酒。

表5 混菌順序發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒指標相關(guān)性分析Table 5 Indexes correlation analysis of Cabernet Sauvignon dry red wines by sequential fermentation with mixed yeasts

3 結(jié)論

本研究采用2種非釀酒酵母與3種釀酒酵母混菌順序發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒，通過分析不同發(fā)酵階段顏色與酚類物質(zhì)的變化及感官品評。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵能夠穩(wěn)定葡萄酒色澤品質(zhì)，提升酚類物質(zhì)含量，提高感官得分。其中以酒樣CM、PF效果最佳，CM能增加3.47%酸度而更好的平衡葡萄酒的口感，PF能更好的提升葡萄酒單寧17.74%、總酚20.96%以增強葡萄酒的結(jié)構(gòu)，從而增強葡萄酒的骨架，根據(jù)AWS感官評價兩者得分均為“優(yōu)秀”，高出對照20%以上，因而為非釀酒酵母的選擇和利用提供了理論依據(jù)。